粘桿菌素快速檢測試劑盒使用說明書

【測定原理】

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物粘桿菌素類藥物將和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭粘桿菌素類藥物抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物粘桿菌素類藥物的含量成負相關(guān)，與標準曲線比較可得出相應殘留物粘桿菌素類藥物的含量。

【試劑盒技術(shù)指標】   

規(guī)      格：96孔/盒

靈 敏 度： 1ppb

檢測時間：45min

樣本檢測下限：

組織樣本（雞、鴨、豬肉/肝、蝦、魚、雞蛋）：

………………………………………………5ppb

牛奶、蜂蜜…………………………………20ppb

反應率：

粘桿菌素 …………………………………………100%  

多粘菌素B ………………………………………95%  

 樣本回收率：

組     織   …………………………………… 85%±20%

牛奶、蜂蜜  ………………………………  80%±20%

【試劑盒組成】

1、 微量測試孔：1×96孔板（12條×8孔）

2、 高濃度標準品：×1瓶：（1ml/瓶）1ppm

3、 酶標記物       7ml………………………紅色帽

4、 抗體工作液   7ml ………………………綠色帽

5、 底物A液      7ml ………………………棕色帽

6、 底物B液     7ml  ……………………黑色帽

7、 終  止  液     7ml  ……………………黃色帽

8、 20X濃縮洗滌液40 ml  ………………白色帽

9、 2X 濃縮復溶液   50ml ·………………藍色帽 

【 所用儀器、試劑】

具備的儀器：酶標儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮 吹儀、刻度移液管

微量移液器：單道 20μl～200μl、單道100μl～1000μl多道 30～300 μl

試           劑：乙腈、正己烷、氯化鈉

【實驗前溶液配制】

配液1：復溶工作液

               2X復溶液在使用前請按1：1稀釋

            （1份濃縮復溶液+1份去離子水）

配液2：洗滌液

              將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用蒸餾水稀釋

             20×濃縮洗滌液在使用前請按1：19稀釋（1份     

             濃縮洗滌液+19份去離子水）（可按需配置）

【樣本前處理步驟】   

樣本前處理須知

處理任何樣本時，都必須注意：

（a）本試劑盒所檢測的組織樣本包括：動物組織、禽類和水產(chǎn)組織。eg:雞、鴨、牛、兔、魚、蝦等。

（b）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

（c）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

  樣本前處理方法

（A）動物組織樣本、蛋類

1、 用均質(zhì)器均質(zhì)樣本；稱取2±0.05g樣本于50ml離心管中，加入0.5g氯化鈉，再加入5ml乙腈，用振蕩器振蕩5分鐘；4000轉(zhuǎn)/分以上,室溫離心10分鐘；

2、 取上清液2.5ml至干凈玻璃試管中，于56℃水浴下氮氣/空氣吹干；

3、 加入1ml正己烷溶解干燥的殘留物，再加1ml稀釋后的復溶液強烈振蕩混合30s，室溫4000r/min以上離心5min。

（注：如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象；可置于80度水浴十分鐘后再次離心）

4、 取50 µl下層相與取200 µl稀釋后的復溶液強烈振蕩混合30s后，取50 µl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：5

（B）牛奶

1、取1ml牛奶樣本于離心管中，在3000r/min，4℃離心10min，

      去除上層脂肪。

2、取50ul上清液，加入950ul 稀釋后的復溶液混勻，混合30s。

3、取50µl液體用于分析。

     樣本稀釋倍數(shù)：20倍

【酶標免疫分析程序】   

操作步驟：

1、 從4℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室 溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 配制標準品應用液；現(xiàn)配現(xiàn)用。

標準品6：濃度為81ppb    

取40.5µl高濃度標準品7溶液用460µl稀釋好的復溶液稀釋并混合均勻

標準品5：濃度為  27ppb

取100µl標準品6用200µl稀釋好的復溶液稀釋  

標準品4：濃度為  9ppb

取100µl標準品5用200µl稀釋好的復溶液稀釋      

標準液3：濃度為  3ppb

取100µl標準品4用200µl稀釋好的復溶液稀釋

標準品2：濃度為  1ppb

取100µl標準品3用200µl稀釋好的復溶液稀釋

標準品1：濃度為  0ppb

直接使用已稀釋好的復溶液作為標準品1即0ppb 

4、 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

5、 加標準品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加入酶標記物50µl/孔和抗體工作液50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。25℃環(huán)境中反應30min。

6、 取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250µl /孔，洗板4－5次，每次間隔15-30s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

7、 顯色：每孔加入底物液A液50µl， 再加B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。

8、 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定每孔吸光度值（OD值）。

【結(jié)果判定】

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含粘桿菌素的含量成負相關(guān)。

1、粗略判定：

    用樣本的平均吸光度值與標準吸光度值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設樣本1的吸光度值為0.310， 樣本2的吸光度值為0.820，標準液吸光度值分別是：0ppb為1.510；1ppb為1.320；3ppb為1.030；9ppb為0.660； 27ppb為0.389；81ppb為0.198。則樣本1的濃度范圍是27ppb-81ppb； 樣本2的濃度范圍是3ppb-9 ppb。乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中粘桿菌素實際濃度。           

2、定量分析：

所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個標準（0標準）的吸光度值（B0）再乘以100%，即：

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

以標準品百分吸光率為縱坐標，以粘桿菌素標準品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中粘桿菌素實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣品的準確、快速分析。

3、標準準曲線：

B/B0 (%)

                   1                   3                    9                    27                  81    

粘桿菌素(ppb) [µg/kg]

圖1：粘桿菌素檢測試劑盒的回歸曲線

4、再現(xiàn)性：

 %CV 

            0       1        3        9       27     81

                   粘桿菌素(ppb) [µg/kg]

           圖2：粘桿菌素檢測試劑盒的精密度

由多個不同的實驗結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出粘桿菌素檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標準吸收值的變異系數(shù)（%CV）對相應粘桿菌素濃度作曲線，可以看到在全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。

【注意事項】

1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標本沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復性不好的現(xiàn)象。

4、 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進自封袋密封；標準物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A_450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8、 該試劑盒最佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【儲存】原包裝應儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】有效期12個月;生產(chǎn)日期、有效期、生產(chǎn)批號見外包裝。