甲硝唑快速檢測試劑盒

（血液）使用說明書

【原理】

本試劑盒是利用競爭ELISA方法，在酶標板微孔上預包被抗 甲硝唑抗原。檢測時，加入標準品或樣品溶液，甲硝唑抗體及酶標記物，包被抗原和加入樣本中的甲硝唑競爭性地與甲硝唑抗體結(jié)合后，再與酶標記物形成抗原抗體復合物，用TMB底物顯色；加入反應終止液，在450nm波長酶標儀下進行檢測，樣品中的甲硝唑濃度與吸收光強度成反比。

【適用范圍】

本試劑盒是應用ELISA技術(shù)研發(fā)的藥物殘留檢測產(chǎn)品,與儀器分析技術(shù)比較，能經(jīng)濟、快速地檢測出肌肉、肝臟等中的甲硝唑類藥物。

【【試劑盒技術(shù)指標】   

規(guī)      格：96孔/盒

靈 敏 度： 0.1ppb

檢測時間：45min

樣本定量檢測下限：  

血   液………………………………………2ppb

樣本回收率

血   液…………………………………80±15%

交叉反應率

甲硝唑………………………………………………100%

【試劑盒組成】   

1、 微量測試孔：（1X96孔板）每條8孔，一板12條

2、 標準液X6瓶：（1ml/瓶） 0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb

3、 高濃度標準品×1瓶：（1ml/瓶）100ppb

4、 酶標記物         7ml…………………………紅色帽

5、 抗體工作液     7ml…………………………綠色帽

6、 底物液 A液    7ml…………………………棕色帽

7、 底物液 B液    7ml…………………………黑色帽

8、 終 止 液          7ml…………………………黃色帽

9、 20X濃縮洗滌液40ml…………………… 白色帽

10、 2X濃縮復溶液50 ml      ………………… 藍色帽

【所用儀器、試劑】   

具備的儀器：微孔酶標儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

微量移液器：單道20µl-200µl、100µl-1000µl，多道250µl

試         劑：去離子水

【實驗前溶液配制】

樣本處理前需配制：

配液1、1×復溶液：

                將2×濃縮復溶液用去離子水以1：1稀釋（1份1×濃縮復溶液+1份去離子水），用于樣本提取和稀釋。

配液2、將40ml濃縮洗滌液（10倍濃縮）用去離子水按照 1：9稀釋（1份濃縮洗滌液+9份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

【樣本前處理方法】   

樣本前處理須知：處理任何樣本時，都必須注意：

（a）本試劑盒所檢測的組織樣本包括：動物組織、

禽類和水產(chǎn)組織。eg:雞、鴨、牛、兔、魚、蝦等。

（b）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

（c）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

樣本前處理步驟

（a）血液樣本的處理

1、取出50μL血液+450μL的1×復溶液液混合30s；

2、取50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：10倍 

【酶標免疫分析程序】   

操作步驟：

1、 從4℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室 溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置

4、 加標準品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加入酶標記物50µl/孔后再加抗體50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。25℃環(huán)境中反應30min。

5、 取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250µl /孔，洗板4－5次，每次間隔15-30s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6、 顯色：每孔加入底物液A液50µl， 再加B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。

7、 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定每孔吸光度值（OD值）。

【結(jié)果判定】

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與甲硝唑的含量成負相關(guān)。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標準吸光度值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設樣本1的吸光度值為0.310， 樣本2的吸光度值為0.820，標準液吸光度值分別是：0ppb為1.610；0.1ppb為1.350；0.3ppb為1.030；0.9ppb為0.660；2.7ppb為0.379；8.1ppb為0.198。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb-8.1ppb； 樣本2的濃度范圍是0.3ppb-0.9ppb。乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中甲硝唑的實際含量。

2、定量判定：

所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個標準（0標準）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

以標準品百分吸光率為縱坐標，以甲硝唑標準品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中甲硝唑實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣品的準確、快速分析。

3、標準準曲線：

B/B0 (%)

                  0.1                 0.3               0.9                2.7               8.1                                                     甲硝唑(ppb) 

圖1：甲硝唑檢測試劑盒的回歸曲線

4、再現(xiàn)性：

%CV

       0      0.1       0.3      0.9     2.7     8.1

甲硝唑(ppb) [µg/kg]

圖2：甲硝唑檢測試劑盒的精密度

  由多個不同的實驗結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出甲硝唑檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標準吸收值的變異系數(shù)（%CV）對相應甲硝唑濃度作曲線，可以看到全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。

【注意事項】   

1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標本沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復性不好的現(xiàn)象。

4、 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進自封袋密封；標準物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A_450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8、 該試劑盒最佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【儲存】

原包裝應儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】

有效期12個月;生產(chǎn)日期、有效期、生產(chǎn)批號見外包裝。