無細(xì)胞蛋白表達技術(shù)實現(xiàn)復(fù)雜轉(zhuǎn)錄因子快速制備

*注：下文出于保密考慮，已隱去蛋白名稱及具體文獻引用。

一、引言

轉(zhuǎn)錄因子（TFs）是調(diào)控多種細(xì)胞通路的關(guān)鍵蛋白，常被稱為 “主控調(diào)節(jié)因子"。其中，轉(zhuǎn)錄因子 L（TF L）在神經(jīng)分化、造血及器官發(fā)生等發(fā)育過程中作用關(guān)鍵，對維持干細(xì)胞多能性和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、眼部等組織的正常發(fā)育十分重要，其失調(diào)與相關(guān)難治性發(fā)育障礙密切相關(guān)，是潛在治療靶點。

然而，TF L的表達與純化（尤其全長形式或特定功能結(jié)構(gòu)域）因蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜具有挑戰(zhàn)性：其含LIM結(jié)構(gòu)域、同源結(jié)構(gòu)域及內(nèi)在無序區(qū)域，在大腸桿菌中表達易錯誤折疊形成包涵體，復(fù)性條件難優(yōu)化且功能蛋白得率低；昆蟲細(xì)胞（Sf9）、哺乳動物細(xì)胞（HEK293、CHO）、酵母（畢赤酵母）等其他系統(tǒng)也存在得率不足、純化復(fù)雜、蛋白降解等問題。這些難題嚴(yán)重限制了TF L的結(jié)構(gòu)與功能研究，阻礙了靶向療法研發(fā)。

本應(yīng)用我們采用eProtein Discovery系統(tǒng)成功表達并純化了全長TF L，以及一個未知功能結(jié)構(gòu)域（L2）及其結(jié)合結(jié)構(gòu)域（L3）。通過使用可溶性標(biāo)簽，以及富含鋅離子（Zn2?）和二硫鍵形成劑的無細(xì)胞混合體系，我們優(yōu)化了可溶性TF L蛋白的制備流程。利用標(biāo)記488 Atto染料、含TF L結(jié)合位點的雙鏈DNA，對純化后蛋白的 DNA 結(jié)合功能進行了驗證。研究結(jié)果不僅解決了TF L合成領(lǐng)域長期存在的技術(shù)難題，更為治療性藥物研發(fā)開辟了新路徑，同時確立了eProtein Discovery系統(tǒng)作為復(fù)雜轉(zhuǎn)錄因子研究與制備領(lǐng)域變革性工具的核心地位。

二、無細(xì)胞蛋白表達系統(tǒng)工作流程

eProtein Discovery系統(tǒng)利用數(shù)字微流控技術(shù)，可自動篩選多種DNA 構(gòu)建體（eGene構(gòu)建體）和無細(xì)胞混合體系，優(yōu)化可溶性目標(biāo)蛋白的制備與純化條件（圖 1）。系統(tǒng)能在24小時內(nèi)生成192組表達數(shù)據(jù)和30組純化數(shù)據(jù)，這一快速篩選能力加速了蛋白放大生產(chǎn)條件的確定。僅需48小時，用戶即可完成從DNA到可溶性、經(jīng)純化且可直接用于實驗的蛋白制備，較大程度簡化了生產(chǎn)流程，推動科研與治療性蛋白研發(fā)的快速推進。

圖1：eProtein Discovery系統(tǒng)流程圖：48小時內(nèi)完成從DNA到可直接用于實驗的蛋白制備。

三、方法

1、eProtein Discovery系統(tǒng)篩選

本研究利用eProtein Discovery系統(tǒng)開展結(jié)構(gòu)預(yù)測、實驗運行、數(shù)據(jù)可視化及分析工作。樣品制備采用可溶性標(biāo)簽篩選技術(shù)，將eGene構(gòu)建體加載至eProtein Discovery篩選卡盒中完成。本研究選取了三種TF L變體（圖 2）：全長蛋白、未知功能結(jié)構(gòu)域（L2）及 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（L3）。將這些變體導(dǎo)入eProtein Discovery云軟件進行密碼子優(yōu)化后，在其兩端添加3C和TEV序列。L2和L3變體的設(shè)計借助系統(tǒng)內(nèi)置的 AlphaFold 結(jié)構(gòu)預(yù)測工具，通過精準(zhǔn)識別并分離TF L的重要功能區(qū)域完成。使用eGene制備試劑盒（可溶性標(biāo)簽篩選）構(gòu)建含不同可溶性標(biāo)簽的表達載體，同時構(gòu)建1個無可溶性標(biāo)簽的對照載體，最終獲得24個 eGene構(gòu)建體（圖 3a）。每個構(gòu)建體的C端均含鏈霉親和標(biāo)簽（Strep-tag）（用于磁珠純化）和檢測標(biāo)簽（用于蛋白表達及純化后的定量分析）。

圖2：TF L變體的AlphaFold結(jié)構(gòu)預(yù)測。圖示為全長TF L的預(yù)測結(jié)構(gòu)（重點關(guān)注區(qū)域已高亮標(biāo)注）。蛋白變體L2和L3基于上述區(qū)域篩選設(shè)計，同時獲得了這些截短蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果。

圖3：eGene構(gòu)建體與無細(xì)胞混合體系的篩選。(A) 含可溶性標(biāo)簽的TF L eGene構(gòu)建體設(shè)計方案。(B) 用于提高可溶性蛋白得率的無細(xì)胞混合體系篩選結(jié)果。

本研究選取8種無細(xì)胞混合體系，其包含無細(xì)胞核心蛋白翻譯機制，并添加了金屬輔因子、分子伴侶（DnaK）、二硫鍵促進劑（PDI+/GSSG）及用于可溶性標(biāo)簽切除的 3C 蛋白酶（圖 3b）。鑒于TF L含兩個 LIM 結(jié)構(gòu)域，特選用Zn2?，推測其可穩(wěn)定TF L中這些富含半胱氨酸的鋅結(jié)合區(qū)域。

將24個eGene構(gòu)建體、8種無細(xì)胞混合體系，連同純化磁珠、對照樣品、空白樣品及洗脫緩沖液一同加載至卡盒中。借助eProtein Discovery系統(tǒng)的自動化功能，該實驗設(shè)置可生成并分析192組表達圖譜。系統(tǒng)自動篩選出每種TF L變體對應(yīng)的10組高表達eGene/無細(xì)胞混合體系組合用于純化，并通過蛋白檢測確定預(yù)測放大生產(chǎn)得率，上述所有流程均在24小時內(nèi)完成。

2、放大生產(chǎn)蛋白質(zhì)

針對每種TF L變體，選取預(yù)測純化得率最高的無細(xì)胞表達組合進行過夜放大培養(yǎng)，采用放大生產(chǎn)專用試劑純化，最終獲得微克級目標(biāo)蛋白。通過SDS-PAGE和Western blot實驗，驗證了蛋白的成功表達與純化。

3、DNA 結(jié)合實驗

通過DNA結(jié)合電泳遷移率變動分析（EMSA）評估蛋白的 DNA 結(jié)合能力并驗證其正確折疊。將放大生產(chǎn)獲得的TF L變體與Atto 488標(biāo)記的雙鏈DNA（dsDNA）共同孵育（該dsDNA通過退火含TF L結(jié)合位點的單鏈 DNA（ssDNA）制備）。樣品在4–16%天然凝膠中電泳，通過與游離DNA探針對比評估遷移率變動。采用含突變TF L結(jié)合位點的陰性對照驗證結(jié)合特異性。針對全長TF L，設(shè)置三個濃度梯度以探究蛋白濃度對DNA-TF L復(fù)合物形成的影響。

四、數(shù)據(jù)與討論

eProtein Discovery系統(tǒng)在轉(zhuǎn)錄因子L（TF L）的全長蛋白、未知功能結(jié)構(gòu)域（L2）及結(jié)合結(jié)構(gòu)域（L3）的表達與純化中展現(xiàn)出出色效率。該技術(shù)24小時內(nèi)快速篩選192組表達條件，生成30組可純化性數(shù)據(jù)。通過全面篩選，成功確定了可溶性功能性TF L變體的制備條件。如圖 4 所示，已明確獲得更高表達及純化效果的可溶性標(biāo)簽與無細(xì)胞混合體系組合，凸顯了該系統(tǒng)通過精準(zhǔn)優(yōu)化條件以實現(xiàn)更高得率和純度的核心能力。

在篩選出的Top30表達條件中，所有構(gòu)建體均含可溶性標(biāo)簽，凸顯其在獲得可溶性及可純化蛋白得率中的關(guān)鍵作用。全長TF L和L2采用P17可溶性標(biāo)簽，L3采用CUSF標(biāo)簽，與無可溶性標(biāo)簽的構(gòu)建體相比，蛋白表達量提升1.83倍。這一結(jié)果表明，該技術(shù)可通過策略性標(biāo)簽篩選優(yōu)化表達效率，對需表達復(fù)雜難制備蛋白的研究人員而言是核心優(yōu)勢。

此外，無細(xì)胞混合體系的使用進一步提高了表達得率。每個體系均含Zn2?，其對穩(wěn)定TF L中富含半胱氨酸的鋅結(jié)合區(qū)域十分重要。添加GSSG使全長TF L的蛋白表達量提升約11%，而蛋白二硫鍵異構(gòu)酶（PDI?）與 GSSG 的組合使L2和L3的表達量分別顯著提升75%和47%（緩沖液 + Zn2?組數(shù)據(jù)未展示）。GSSG和PDI?/GSSG提供的氧化環(huán)境可維持半胱氨酸殘基的氧化還原狀態(tài)，進而支持蛋白正確折疊，這對TF L的結(jié)構(gòu)完整性十分重要。盡管TF L本身不含二硫鍵，但維持適宜的氧化還原環(huán)境可避免異常相互作用（如半胱氨酸錯配或蛋白聚集），確保LIM結(jié)構(gòu)域中鋅離子的正確配位。

圖4：TF L變體的表達與純化結(jié)果。

將優(yōu)化后的構(gòu)建體和無細(xì)胞混合體系混合進行過夜放大培養(yǎng)，在1.5 mL離心管中獲得微克級的各TF L變體蛋白。SDS-PAGE分析證實蛋白成功表達并純化，考馬斯亮藍(lán)染色凝膠顯示，洗脫泳道中出現(xiàn)與預(yù)期分子量一致的單一蛋白條帶，表明純化后蛋白純度達標(biāo)（圖5）。通過抗Strep-tag II抗體驗證了L2和L3變體C端鏈霉親和標(biāo)簽（Strep-tag）的存在，證實完整蛋白序列已成功合成（圖5）。

圖5：放大生產(chǎn)結(jié)果。

為驗證合成蛋白的功能，開展了DNA結(jié)合EMSA實驗。結(jié)果證實，eProtein Discovery系統(tǒng)制備的蛋白保留了天然功能：全長TF L與含其結(jié)合位點的Atto 488標(biāo)記 DNA 探針呈濃度依賴性結(jié)合，天然凝膠上可見清晰遷移率變動（圖6A）；L3結(jié)合結(jié)構(gòu)域也成功與DNA探針形成復(fù)合物，而陰性對照（含突變TF L結(jié)合位點的 DNA）無結(jié)合現(xiàn)象，證實了相互作用的特異性（圖6B）。值得注意的是，L2結(jié)構(gòu)域未與DNA結(jié)合，提示其在TF L中可能承擔(dān)其他結(jié)構(gòu)或功能角色，這對TF L的調(diào)控活性可能十分重要。

圖6：DNA結(jié)合EMSA實驗結(jié)果。(A) 不同濃度的全長TF L與含TF L結(jié)合位點的Atto 488標(biāo)記雙鏈DNA（dsDNA）孵育后，經(jīng)天然凝膠分析的結(jié)果；采用含突變TF L結(jié)合位點的陰性對照探針驗證結(jié)合特異性。(B) TF L未知功能結(jié)構(gòu)域（L2）及結(jié)合結(jié)構(gòu)域（L3）的 DNA 結(jié)合能力評估結(jié)果。

五、結(jié)論

eProtein Discovery 系統(tǒng)是攻克轉(zhuǎn)錄因子 L（TF L）表達與純化難題的突破性工具，該蛋白對發(fā)育生物學(xué)和治療創(chuàng)新十分重要。相較于傳統(tǒng)方法易導(dǎo)致蛋白錯折疊、得率低的問題，該系統(tǒng)借助數(shù)字微流控技術(shù)，能快速優(yōu)化表達條件，48小時內(nèi)即可提效制備高質(zhì)量功能性蛋白，且經(jīng)DNA結(jié)合實驗證實其關(guān)鍵生物學(xué)功能得以保留。該系統(tǒng)為藥物研發(fā)、再生醫(yī)學(xué)及復(fù)雜蛋白研究提供了核心支撐，助力加速科研突破。

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