TFL無細胞蛋白制備與篩選——eProtein Discovery蛋白表達系統(tǒng)應用案例（下篇）

摘要：eProtein Discovery系統(tǒng)完成困難轉錄因子的制備、純化與功能驗證，驗證其應用效果并拓展其多領域科研應用價值。

關鍵詞：蛋白表達系統(tǒng) ,eProtein Discovery,無細胞蛋白表達,無細胞蛋白合成,難表達蛋白快速制備,數(shù)字微流控,轉錄因子制備

一、TFL的無細胞蛋白制備與篩選方案

基于上篇解析的eProtein Discovery無細胞系統(tǒng)核心技術與工作流程，研究人員針對TF L這類高度無序的難表達轉錄因子，開展了專項無細胞蛋白表達與純化研究，逐步形成了完整的難表達蛋白快速獲取方案。該方案全程嚴格遵循無細胞蛋白合成邏輯，優(yōu)化每一步實驗條件，確保實驗結果的可靠性，具體方案如下：

• 構建體設計與制備：選取全長TF L、未知功能結構域L2、DNA結合結構域L3三種蛋白變體，通過系統(tǒng)內置的AlphaFold結構預測工具設計L2、L3，將三種變體導入系統(tǒng)云軟件優(yōu)化密碼子后，添加3C和TEV序列；利用可溶性標簽篩選技術，構建24個含不同可溶性標簽的eGene構建體及1個無標簽對照構建體，所有構建體C端均整合Strep標簽和檢測標簽，分別用于磁珠純化和蛋白定量。

• 無細胞混合體系配置：選取8種無細胞混合體系，在核心翻譯機制基礎上，添加金屬輔因子、分子伴侶、二硫鍵促進劑及3C蛋白酶；結合TF L含兩個LIM結構域的特點，在體系中加入Zn2?，穩(wěn)定蛋白鋅結合區(qū)域，為蛋白正確折疊提供適配環(huán)境。

• 自動化篩選與分析：將24個eGene構建體、8種無細胞混合體系及純化磁珠、對照樣品、緩沖液等加載至微流控卡盒，系統(tǒng)自動生成并分析192組表達圖譜，24小時內篩選出每種蛋白變體對應的10組高表達組合并完成純化，確定各變體的放大生產預測得率，為后續(xù)放大制備提供數(shù)據(jù)支撐。

二、TFL制備結果與功能驗證

按照上述制備與篩選方案，研究人員依托eProtein Discovery系統(tǒng)，成功完成了三種TF L變體的制備與純化。通過系統(tǒng)分析篩選數(shù)據(jù)、蛋白制備結果及功能驗證實驗，不僅驗證了該系統(tǒng)在難表達蛋白制備中的應用效果，也為無細胞蛋白合成技術在轉錄因子研究中的多種應用提供了堅實的實驗依據(jù)，具體結果如下：

• 篩選數(shù)據(jù)揭示優(yōu)化方向：系統(tǒng)篩選的30組高得率表達條件中，所有構建體均含可溶性標簽，全長TF L和L2適配P17標簽，L3適配CUSF標簽，與無標簽構建體相比，蛋白表達量有所提升，體現(xiàn)了可溶性標簽在蛋白可溶性功能篩選中的作用；無細胞混合體系中，Zn2?可穩(wěn)定蛋白結構，GSSG、PDI?/GSSG的氧化環(huán)境配置，可提升不同蛋白變體的表達量，為復雜蛋白無細胞表達條件優(yōu)化提供參考。

圖1：TF L變體的AlphaFold結構預測。圖示為全長TF L的預測結構（重點關注區(qū)域已高亮標注）。蛋白變體L2和L3基于上述區(qū)域篩選設計，同時獲得了這些截短蛋白的結構預測結果。

圖2：eGene構建體與無細胞混合體系的篩選。(A) 含可溶性標簽的TF L eGene構建體設計方案。(B) 用于提高可溶性蛋白得率的無細胞混合體系篩選結果。

• 放大制備獲得高純度蛋白：選取適配表達組合進行過夜放大培養(yǎng)，在1.5mL體系中成功獲得微克級三種TF L變體蛋白；SDS-PAGE分析顯示，純化后蛋白出現(xiàn)與預期分子量一致的單一條帶，Western blot實驗驗證了蛋白標簽的完整性，證實蛋白成功表達與純化，可滿足后續(xù)功能實驗需求。

• 功能驗證證實蛋白活性：通過DNA結合電泳遷移率變動分析驗證蛋白生物學功能，結果顯示，全長TF L可與含結合位點的標記DNA發(fā)生濃度依賴性結合，L3結構域可與DNA探針形成特異性復合物，陰性對照無結合現(xiàn)象；L2結構域未表現(xiàn)出DNA結合能力，為其功能研究提供了新線索，也證實eProtein Discovery系統(tǒng)制備的蛋白保留天然生物學功能。

三、無細胞蛋白表達技術的應用價值

結合本次TF L的制備與驗證實驗，eProtein Discovery系統(tǒng)憑借無細胞蛋白合成的獨特技術特點，成功解決了TF L這類高度無序轉錄因子的制備難題，48小時內即可完成從DNA到功能性蛋白的全流程制備，有效突破了傳統(tǒng)表達體系在復雜蛋白制備中的技術限制，為難表達蛋白研究提供了全新的技術路徑。

除了轉錄因子制備，該系統(tǒng)還整合數(shù)字微流控、無細胞蛋白表達、熒光蛋白定量檢測等技術，實現(xiàn)表達條件的高通量篩選與準確優(yōu)化，可完成可溶性蛋白快速制備，其篩選結果可與體內表達體系銜接，可進行規(guī)模化制備。

在AI蛋白工程、de novo蛋白設計等前沿科研領域，eProtein Discovery系統(tǒng)可發(fā)揮難表達蛋白快速獲取的優(yōu)勢，為人工設計蛋白、新型功能蛋白的制備與驗證提供支撐，助力科研人員開展蛋白結構研究、靶向藥物研發(fā)、再生醫(yī)學等探索，推動無細胞蛋白表達技術在更多科研場景落地。上海曼博生物作為正式的nuclera中國代理，為國內科研人員、生物醫(yī)藥企業(yè)提供eProtein Discovery系統(tǒng)的產品咨詢、采購安裝、技術支持等全流程服務，如您需要可掃描下方圖片訪問曼博生物網(wǎng)站查看具體應用方案！

本文基于eProtein Discovery無細胞系統(tǒng)公開資料由其中國提供商上海曼博生物整理，用于科研信息分享和實驗參考。上海曼博生物可提供eProtein Discovery蛋白表達系統(tǒng)、無細胞蛋白表達篩選系統(tǒng)、難表達蛋白快速制備及相關技術支持。