GPCR無細胞表達與納米盤篩選：72小時獲得功能性β1AR

G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）是35%獲批藥物的靶點，但已解析結構的受體數量很少，主要難點在于傳統(tǒng)去垢劑體系難以獲得穩(wěn)定、有功能的樣品。去垢劑會剝離保護性脂質，導致蛋白聚集、配體結合能力下降，往往需要數周反復優(yōu)化才能滿足實驗需求。

無細胞蛋白合成（CFPS）技術可有效解決這一問題，能避免細胞毒性并實現(xiàn)膜蛋白共翻譯整合。在體系中加入預組裝的脂質納米盤后，新合成的GPCR可直接插入近天然的脂雙層環(huán)境中。這種無需去垢劑、“合成即穩(wěn)定"的策略能夠保留關鍵的脂質-蛋白相互作用，并支持對可調控設計參數（支架尺寸、脂質組成）進行快速篩選優(yōu)化，大幅提升蛋白表達量與功能性折疊效率。

圖1.無細胞蛋白合成體系可在翻譯過程中實現(xiàn)GPCR向特定脂質環(huán)境的共翻譯插入。

eProteinDiscoveryGPCR納米盤篩選試劑盒通過優(yōu)化膜支架蛋白尺寸與脂質組分，結合自動化數字微流控快速平行篩選，可在短時間內確定GPCR理想的表達條件并獲得可直接用于實驗的活性蛋白。

圖2.eProteinDiscovery無細胞蛋白表達篩選系統(tǒng)工作流程。

本應用展示了一套快速制備高活性熱穩(wěn)定截短型火雞 β1腎上腺素能受體（ttsΔβ1AR）的實驗流程。借助eProteinDiscovery微流控無細胞蛋白表達技術，高通量篩選并確定了理想脂質組成方案，相較于通用脂質體系可使受體的功能性配體結合活性提升3倍。目標受體放大表達后，通過尺寸排阻色譜（SEC）精制將活性單體比例富集至約45%，從而實現(xiàn)了在72小時內獲得了可滿足結構解析要求的高純度ttsΔβ1AR。

一、GPCR無細胞篩選β1AR制備方法

1. 序列設計與DNA制備

人源全長β1腎上腺素能受體（hβ1AR）、人源全長熱穩(wěn)定型β1腎上腺素能受體（htsβ1AR）及熱穩(wěn)定截短型火雞 β1腎上腺素能受體（ttsΔβ1AR）的表達構建體均基于Kock等人與Rues等人的前期研究進行設計。分別在受體序列的N端與C端引入3C酶切位點與TEV酶切位點接頭序列，隨后通過eGeneFlexiVariant試劑盒將目標序列組裝為適配eProteinDiscovery系統(tǒng)的線性DNA模板。

2. eProteinDiscovery無細胞蛋白表達篩選

采用eProteinDiscovery系統(tǒng)及微流控芯片，對3種β1AR變體與8組無細胞反應體系進行自動化多重篩選。每種體系包含無細胞表達試劑、PDI/GSSG氧化還原混合液，以及預組裝納米盤或緩沖液對照。共測試7種納米盤：其中4種來自GPCR納米盤篩選試劑盒，3種為通用型納米盤（表1）。其余表達與純化試劑均采用膜蛋白專用試劑盒配套試劑。

表1.用于eProteinDiscovery多重篩選的8組無細胞反應體系。

3. 放大表達

參照優(yōu)化方案進行放大表達：用于初步LAC分析時，構建含DNA構建體、無細胞表達試劑、PDI/GSSG以及MSP1E3D1納米盤等的反應體系，29℃過夜孵育，經鏈霉親和素磁珠純化后，對粗產物和洗脫液進行SDS-PAGE分析；用于制備型SEC時，構建3mL反應體系并分為1mL等分孵育，加入RNaseA處理后純化、合并洗脫液并濃縮，蛋白產量采用eProtein定量試劑盒測定。

4. 制備型SEC與SE-UHPLC

將濃縮的ttsΔβ1AR放大樣品上樣至經SEC運行緩沖液預平衡的Superdex200 Increase 10/300凝膠過濾柱，收集各峰組分并濃縮至約50μL，速凍后于-80℃保存。

采用WatersACQUITYPremier系統(tǒng)對SEC組分進行分析型SE-UHPLC驗證。取10μL過濾樣品上樣至蛋白SEC色譜柱，柱溫25℃、樣品室4℃；以含磷酸氫二鈉、NaCl和精氨酸的緩沖液（pH7.5）為流動相，0.4mL/min流速運行8min，通過色氨酸熒光檢測蛋白洗脫。

5. 配體親和層析

取7.5μg純化的ttsΔβ1AR，與20μL預平衡的瓊脂糖樹脂于微型離心柱中4℃孵育2小時。

用洗滌緩沖液洗滌樹脂3次，加入含異丙腎上腺素的洗脫緩沖液室溫孵育2小時后離心洗脫活性受體。采用eProtein定量試劑盒測定蛋白濃度，并通過比較層析前后蛋白量計算結合率。

二、GPCR無細胞篩選β1AR實驗結果

1. 24小時高通量篩選降低GPCR制備風險

使用eProteinDiscovery無細胞蛋白表達篩選系統(tǒng)，可在24小時內完成3種β1AR變體在8組無細胞混合體系中的表達與純化產量分析。該步驟可快速確定能有效表達蛋白的載體與條件組合，降低GPCR制備流程風險。如圖3所示，帶負電的納米盤（DOPG、DMPG）在所有β1AR變體中均獲得較大純化產量。其中ttsΔβ1AR變體純化濃度可達約5μM，因此被選用于放大制備與功能表征。

圖3.eProteinDiscovery篩選結果。

2. 從篩選到放大：純化ttsΔβ1AR濃度約100μg/mL

在6種篩選出的納米盤條件下對ttsΔβ1AR進行過夜放大表達，可成功獲得約100μg/mL的純化受體。與篩選結果一致，MSP1E3D1?DOPG和MSP1E3D1?DMPG納米盤組總蛋白產量高（圖4A）。SDS?PAGE結果證實ttsΔβ1AR在目標分子量處成功表達（圖4B）。

圖4.ttsΔβ1AR放大制備結果。(A)ttsΔβ1AR在6種不同MSP-脂質組分體系中的放大純化產量；(B)ttsΔβ1AR在3種體系中放大表達后的電泳圖。

3. nucleraGPCR納米盤使受體活性提升3倍

eProteinDiscovery系統(tǒng)可準確預測蛋白產量并指導放大，但產量高并不代表受體有功能，而脂質組成對GPCR活性構象影響很大。研究通過配體親和層析（LAC）測定放大后樣品的結合率（圖5A）。結果表明，受體功能明顯依賴脂質類型，eProteinDiscoveryGPCR納米盤效果更優(yōu)。在DOPG、POPC/POPS、POPC/POPS/膽固醇體系中，ttsΔβ1AR的功能結合率是DMPG體系的3倍（圖5B），而POPC體系表達的ttsΔβ1AR無活性。

圖5.配體結合初步研究。(A)配體親和層析（LAC）示意圖；(B)ttsΔβ1AR在6種不同MSP-脂質組分中的結合率。

Nuclera的GPCR專用納米盤憑借合理的脂質設計，通過不飽和、帶合適電荷比例的脂質組分提供了適配GPCR的柔性天然膜環(huán)境，大幅提升了β1AR活性，遠優(yōu)于飽和脂質或純中性脂質體系。

4. SEC精制將單體配體結合活性組分富集至45%

選用活性與產量優(yōu)的DOPG體系表達的ttsΔβ1AR進行制備型SEC精制，分離去除聚集體與錯誤組裝蛋白，得到單體目標復合物；經檢測，峰3活性結合率達45%，較初始純化提升3倍，可用于后續(xù)結構和功能研究。

圖6.ttsΔβ1AR樣品質量富集。(A)MSP1E3D1-DOPG體系表達產物的SEC圖譜；(B)各SEC組分的分析型SE-UHPLC結果；(C)LAC結合分析顯示峰3活性組分提升3倍。

三、無細胞篩選在GPCR制備中的應用總結

eProteinDiscovery系統(tǒng)工作流程將膜蛋白迭代優(yōu)化周期從數月縮短至數天。采用快速自動化無細胞蛋白表達篩選，替代了耗時的細胞宿主構建和去垢劑篩選，可在72小時內獲得活性GPCR蛋白。

該系統(tǒng)能高通量篩選DNA構建體與納米盤組合，快速確定高產優(yōu)質條件，相比普通脂質配方，其功能配體結合活性提升3倍。這種自動化篩選與近天然納米盤體系，為結構生物學和藥物靶點發(fā)現(xiàn)提供了穩(wěn)定的高質量受體樣品制備方案。

上海曼博生物（MineBio）為英國nuclera品牌在中國供應商，專注無細胞蛋白表達等前沿技術在生命科學研究中的應用。更多關于nucleraeProtein Discovery無細胞蛋白表達技術支持掃描下方圖片或者訪問曼博生物網站查看具體內容。