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PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit

PURExpress® 體系是一種基于 PUREsystem™（Shimizu et al.，2001）的重組蛋白合成體系，其中所有體外轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的組份都純化自大腸桿菌。

•    系統(tǒng)中所有蛋白都含有 His 標(biāo)簽，用于轉(zhuǎn)錄/翻譯偶聯(lián)；核糖體不含 His 標(biāo)簽
•    T7 RNA 聚合酶促成體外轉(zhuǎn)錄
•    核酸酶和蛋白酶活性，以保證合成蛋白和編碼靶標(biāo)的穩(wěn)定性
•    模板可以是質(zhì)粒 DNA、線性 DNA 或 mRNA
•    目標(biāo)蛋白可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)合成并可見
•    合成多種靶標(biāo)肽和蛋白
•    合成的蛋白可進(jìn)行共翻譯放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記
•    蛋白可進(jìn)行反向純化，或直接進(jìn)行功能性分析
•    應(yīng)用包括高通量篩選/定向進(jìn)化、合成生物學(xué)、毒性蛋白或難表達(dá)蛋白合成、蛋白折疊研究、活性研究和蛋白間相互作用
•    基于重組特性，NEB 可以提供多個(gè)移除翻譯因子或大分子的試劑盒，以便進(jìn)行特定研究（見配套產(chǎn)品）
•    與 PURExpress 二硫鍵增強(qiáng)劑（NEB #E6820）兼容

PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit

使用 PURExpress® 體外蛋白合成試劑盒的表達(dá)蛋白

在 25 μl 反應(yīng)體系中加入 250 ng 模板 DNA 和 20 單位 RNase 抑制劑，37℃ 溫育 2 小時(shí)。各取 2.5 μl 反應(yīng)液使用 10 – 20% Tris凝膠進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳分析。紅點(diǎn)處指示為目的蛋白。Marker M 是蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（NEB #P7703 已停產(chǎn)，被 NEB #P7717 替代）。

圖 2：添加 35S-甲硫氨suan通過放射自顯影顯示蛋白

在 25 μl 反應(yīng)中加入 250 ng 模板 DNA、20 單位 RNase 抑制劑以及 2 μl 35S-甲硫氨suan，37℃ 溫育 2 小時(shí)。各取 2.5 μl 反應(yīng)液進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳分析，將凝膠固定 10 分鐘，80℃干燥 2 小時(shí)，并在 -80℃ 條件下使用 射線膠片曝光 5 小時(shí)。

圖 3：使用 PURExpress 體系進(jìn)行蛋白合成和純化示意圖

圖 4：使用 PURExpress 體系表達(dá)和反向純化 DHFR 和 T4 DNA 連接酶

根據(jù)隨附產(chǎn)品說明書中的建議，使用 125 μl 的反應(yīng)體系。樣本使用經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色的 10 – 20% Tris凝膠進(jìn)行分析。在這兩種情況下，目的蛋白都可以在總蛋白質(zhì)的條帶中可見。紅點(diǎn)處指示為目的蛋白。

上海寶葉生物科技有限公司

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