基本原理 【動(dòng)畫(huà)】

    免疫印跡法（immunoblotting test，IBT）亦稱(chēng)酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印斑法（enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB），因與Southen早先建立的檢測(cè)核酸的印跡方法Southen blot相類(lèi)似，亦被稱(chēng)為Western blot。免疫印跡（western blotting）是在蛋白質(zhì)電泳分離和抗原抗體檢測(cè)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)一項(xiàng)檢測(cè)蛋白質(zhì)的技術(shù)。它將SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的高分辨力與抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合。
    典型的印跡實(shí)驗(yàn)包括三個(gè)步驟：
    ①蛋白質(zhì)的電泳分離
    ②將電泳后凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至固體膜上，用非特異性，非反應(yīng)活性分子封閉固體膜上未吸附蛋白質(zhì)區(qū)域
    ③免疫學(xué)檢測(cè)。免疫印跡克服了聚丙烯酰胺凝膠電泳后直接在凝膠上進(jìn)行免疫學(xué)分析的弊端，極大地提高了其利用率、分辨率和靈敏度，使其成為使用zui廣泛的免疫化學(xué)方法之一。

免疫印跡法原理示意圖

    *階段為SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）?？乖鹊鞍讟悠方?jīng)SDS處理后帶陰電荷，在聚丙烯酰酰凝膠中從陰極向陽(yáng)極泳動(dòng)，分子量越小，泳動(dòng)速度就越快。此階段分離效果肉眼不可見(jiàn)（只有在染色后才顯出電泳區(qū)帶）。
    
    第二階段為電轉(zhuǎn)移。將在凝膠中已經(jīng)分離的條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，選用低電壓（100V）和大電流（1～2A），通電45min轉(zhuǎn)移即可完成。此階段分離的蛋白質(zhì)條帶肉眼仍不可見(jiàn)。
    
    第三階段為酶免疫定位。將印有蛋白質(zhì)條帶的硝酸纖維素膜（相當(dāng)于包被了抗原的固相載體）依次與特異性抗體和酶標(biāo)第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物的酶反應(yīng)底物，使區(qū)帶染色。常用的HRP底物為3，3，—二氨基聯(lián)苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈藍(lán)紫色）。陽(yáng)性反應(yīng)的條帶清晰可辨，并可根據(jù)SDS-PAGE時(shí)加入的分子量標(biāo)準(zhǔn)，確定各組分的分子量。

    本法綜合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特異性和敏感性，是一個(gè)有效的分析手段，不僅廣泛應(yīng)用于分析抗原組分及其免疫活性，并可用于疾病的診斷。在艾滋病病毒感染中此法作為確診試驗(yàn)?？乖?jīng)電泳轉(zhuǎn)移在硝酸纖維素膜上后，將膜切成小條，配合酶標(biāo)抗體及顯色底物制成的試劑盒可方便地在實(shí)驗(yàn)室中供檢測(cè)用。根據(jù)出現(xiàn)顯色線(xiàn)條的位置可判斷有無(wú)針對(duì)病毒的特異性抗體。

 

樣本的制備

    幾乎任何蛋白質(zhì)都可用于免疫印跡。免疫印跡的優(yōu)勢(shì)是能分析不能用其他的免疫化學(xué)技術(shù)進(jìn)行研究的蛋白質(zhì)樣品。例如，不能標(biāo)記的蛋白質(zhì)或不溶于溫和抽提緩沖液的蛋白質(zhì)等。免疫印跡還可分析各種組織、器官或微生物等來(lái)源的粗制樣品。
    用于免疫印跡的樣本種類(lèi)繁多，處理的方法也有所不同，為了選擇理想的處理方法，應(yīng)當(dāng)考慮細(xì)胞的類(lèi)型和待測(cè)抗原的性質(zhì)。

 細(xì)菌表達(dá)蛋白質(zhì)和樣本制備

一般直接用SDS凝膠加樣緩沖液裂解，具體方法如下：

    [試劑與設(shè)備]
    （1）表達(dá)待檢測(cè)蛋白質(zhì)的細(xì)菌。
    （2）50mmoL／LTris-HCl（pH7.4）。
    （3）2xSDS凝膠加樣緩沖液：
        100mmol／L Tris—HCl（pH6.8）
        200mmol／L 二硫蘇糖醇（DTT）
        4％ SDS（電泳級(jí)）
        0.2％ 溴酚藍(lán)
        20％ 甘油
    不含有二硫蘇糖醇（DTT）的2XSDS凝膠加樣緩沖液可保存于室溫，臨用前須從1mol／L二硫蘇糖醇儲(chǔ)存液現(xiàn)用現(xiàn)加于上述緩沖液中。
    （4）臺(tái)式離心機(jī)。
    （5）超聲破碎儀。
    （6）水浴箱。
    （7）渦漩振蕩器。
    （8）加樣器與吸頭等。

    [操作步驟]
    （1）表達(dá)靶蛋白大腸桿菌經(jīng)誘導(dǎo)適當(dāng)時(shí)間后，用微量離心機(jī)以12 000g離心30s，收集1ml培養(yǎng)的菌體。
    （2）吸取培養(yǎng)液，加入0.5ml用冰預(yù)冷的50mmol／LTris—HCl（pH7.4），振蕩沉淀的菌體，
使之復(fù)懸，用微量離心機(jī)于0°C以12000g離心30s回收菌體。
    （3）再次吸出上清液，小心地吸凈管壁上的液滴，盡可能使沉淀物不帶有殘留液體。
    （4）加入25μl水，振蕩使沉淀復(fù)懸，一旦菌體分散開(kāi)來(lái)，立即加入25μl 2XSDS凝膠加樣緩沖液，繼續(xù)振蕩20s。
    （5）樣品在沸水浴中放置5min。
    （6）采用帶有浸入尖頭或能在冷卻杯中同時(shí)處理多個(gè)樣品的超聲處理儀對(duì)DNA進(jìn)行剪切，根據(jù)所用超聲處理儀的輸出功率及其設(shè)定狀態(tài)，以zui大功率處理0.5—2min應(yīng)能有效地將裂解液粘度降至可控水平；
    （7）樣品于室溫以12000g離心10min，將上清液移至另一管中，棄沉淀物；
    （8）吸取經(jīng)剪切或超聲處理的樣品25μl電泳，剩余樣品保存于—20~C備用。

 

 快速裂解酵母細(xì)胞制備樣本

    使用這種方法會(huì)使蛋白質(zhì)變性，在所用抗體能識(shí)別變性靶蛋白時(shí)才能使用這一方法。

    [試劑與設(shè)備]
    （1）待檢測(cè)的酵母菌。
    （2）25％三氯乙酸（TCA）
    （3）1％SDS。
    （4）丙酮。
    （5）RIPA緩沖液：
        50mmol／L Tris—HCl（pH7.5）
        150mmol／L NaCl
        1％ Nonidet P-40 （NP-40）
        0.5％ 去氧膽酸鈉
        0.1％ SDS
    （6）玻璃珠（直徑0.45—0.50mm）。
    （7）臺(tái)式離心機(jī)。
    （8）水浴箱。
    （9）渦漩振蕩器。
    （10）加樣器與吸頭等。

    [操作步驟]
    （1）0°C以12000g離心lmin，從lml培養(yǎng)物中收集細(xì)胞，棄上清液（當(dāng)靶細(xì)胞為分泌型蛋白時(shí)除外）。
    （2）用0．5ml 25％三氯乙酸（TCA）重懸細(xì)胞。
    （3）按步驟1離心回收細(xì)胞，重懸于1ml 90％丙酮中。
    （4）按步驟（1）離心，估算沉淀物體積，加入等體積1％SDS重新懸浮沉淀物。
    （5）加入經(jīng)酸處理的玻璃珠（直徑0．45—0．50mm）至溶液的彎月面處。
    （6）振蕩懸液5次，每次間歇期間將懸液置于冰浴中冷卻lmin，在相差顯微鏡下監(jiān)測(cè)細(xì)胞
    （7）用一燒紅的皮下注射器針頭（23號(hào)）在微量離心管的頂蓋上穿一小洞，以防加熱過(guò)程中玻璃球沖出離心管。
    （8）在沸水浴中加熱3min。
    （9）把玻璃珠轉(zhuǎn)移到另一個(gè)微量離心管中，用0.5ml RIPA緩沖液洗滌原離心管，并把洗液合并于內(nèi)裝玻璃珠的管中。
    （10）在微量離心管底部打一小洞，回收細(xì)胞提取液，這一操作使用燒紅的皮下注射器針頭效果*。把仍裝載玻璃球的微量離心管置于另一空微量離心管上，把如此重疊的一對(duì)微量離心管，于4°C以2000g離心2min。
    （11）回收下面一只內(nèi)有細(xì)胞提取液的微量離心管，于4°C12以2000g離心5min，使提取液澄清，移出上清液置于另一個(gè)微量離心管中，—20°C貯存?zhèn)溆谩?br />
    [注意事項(xiàng)]
    酵母細(xì)胞提取液儲(chǔ)存于—20°C一般是穩(wěn)定的，但是，如果待測(cè)蛋白被水解，則應(yīng)在提取液中加入蛋白酶抑制劑，并保存于0°C。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織的樣本制備 【動(dòng)畫(huà)】

    哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織有單層培養(yǎng)細(xì)胞、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞和組織碎片，雖然均可采用凝膠加樣緩沖液裂解的方法來(lái)制備樣本，但制備方法有所差異。
    這里介紹其中兩種方法：①對(duì)單層細(xì)胞的處理方法 ②對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞和組織碎片的處理方法

對(duì)單層細(xì)胞的處理方法

    [試劑與設(shè)備]
    （1）磷酸緩沖鹽溶液（PBS）。
    （2）1XSDS凝膠加樣緩沖液（參見(jiàn)“細(xì)菌表達(dá)蛋白質(zhì)和樣本制備”）。
    （3）水浴箱。
    （4）吸管、細(xì)胞刮棒等。

    [操作步驟]
    （1）用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）漂洗細(xì)胞2次，棄去洗液并吸凈殘余的PBS液體。
    （2）如直徑為90mm的平皿，則加人100-200μl加熱到85°C的1XSDS凝膠加樣緩沖液溶解細(xì)胞，用細(xì)胞刮棒把粘稠狀的細(xì)胞裂解物收集于一個(gè)微量離心管中。

對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞和組織碎片的處理方法

    [試劑與設(shè)備]
    （1）懸浮緩沖液的配制：
        0.1mol／L NaCl
        0.01mol／L Tris—IICI（pH7.6）
        0.001mol／L EDTA（pH 8.0）
        1μl／ml Aprotinin
        100μg／ml 苯甲基磺酰氟（PMSF）
    （2）2XSDS凝膠加樣緩沖液（參見(jiàn)“細(xì)菌表達(dá)蛋白質(zhì)和樣本制備”）。
    （3）臺(tái)式離心機(jī)。
    （4）吸管或真空抽吸裝置。
    （5）加樣器和吸頭等。

    [操作步驟]
    （1）取1s組織或109細(xì)胞，加lml冰預(yù)冷的懸浮緩沖液分散細(xì)胞或組織碎片（把細(xì)胞懸浮于上述緩沖液是為了防止加入2XSDS凝膠加樣緩沖液時(shí)形成不溶性團(tuán)塊，這一步應(yīng)使用冰預(yù)冷的懸浮緩沖液而且操作應(yīng)盡可能迅速，以減少蛋白質(zhì)降解。大多數(shù)哺乳動(dòng)物組織可以在懸浮緩沖液液面之下迅速用鑷子分開(kāi)或用剪刀剪碎。）
    （2）于4℃以3000g離心5min，估算離心管底部沉淀物的體積。
    （3）吸出上清液，用連接于抽真空裝置的一次性使用吸頭把管壁上的液滴吸凈。
    （4）盡快加入等體積的2XSDS凝膠加樣緩沖液。

    [注意事項(xiàng)]
    PMSF 嚴(yán)重?fù)p害呼吸道粘膜、眼睛及皮膚，吸人、吞進(jìn)或通過(guò)皮膚吸收后有致命危險(xiǎn)。一旦眼睛或皮膚接觸了PMSF，應(yīng)立即用大量水沖洗之，凡被PMSF污染的衣物應(yīng)予丟棄。PMSF在水溶液中不穩(wěn)定，應(yīng)在臨用前從儲(chǔ)存液中現(xiàn)加于裂解緩沖液中。PMSF在水溶液中的活性喪失速率隨pH的升高而加快，且25℃的失活速率高于4℃。pH值為8.0時(shí)，20μmol／L的PMSF水溶液的半壽期大約為35min，PMSF通常配成10mmol／L或100mmoL／L濃度的貯存液（1.74或17.4mg／ml溶于異丙醇中）保存于-20℃。

免疫沉淀蛋白的樣本制備

    一般情況下，粗提樣品無(wú)需進(jìn)一步純化即可直接進(jìn)行凝膠電泳。但下述兩種情況在免疫印跡之前，使用免疫沉淀制備蛋白的效果較好。一是含量極蛋白的檢測(cè)，由于適合凝膠電泳分辨的蛋白質(zhì)總量有一定限度，通常不可能在凝膠中加入足夠量的蛋白質(zhì)樣品來(lái)檢測(cè)含量極的抗原，此時(shí)可采用標(biāo)準(zhǔn)的免疫沉淀技術(shù)純化和濃縮待測(cè)蛋白；二是免疫沉淀可用來(lái)確定蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，此時(shí)，用于免疫沉淀的抗體和免疫印跡的抗體分別針對(duì)復(fù)合物中的不同蛋白質(zhì)，如果清楚該復(fù)合物的性質(zhì)，并知道應(yīng)該使用何種抗體時(shí)，這種方法就非常有用，為研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用提供了一種有效的方法。

    [試劑與設(shè)備]
    （1）樣品緩沖液。
        Tris／Glyeine SDS—PAGE樣品緩沖液是：2％SDS，100mmol／L DTT（取自—20°C存放的lmoL／L貯存液，臨用前加入），60mmol／L Tris（pH6.8），0.01％溴酚藍(lán)和10％甘油。
    （2）水浴箱。
    （3）加樣器和吸頭等。

    [操作步驟]
    （1）將樣品緩沖液加人吸附有抗原和抗體，并經(jīng)過(guò)洗滌的A蛋白或C蛋白微珠中。使樣品緩沖液和微珠的體積比率至少為2：1—5：1左右更好，但一般不超過(guò)10：1.
    （2）樣品置70°C水浴加熱至少5min。除特殊情況外，在凝膠內(nèi)加樣之前不必去除微珠。
    （3）樣品既可立即使用也可凍存。—20°C存放的樣品可穩(wěn)定保存數(shù)月。

    [注意事項(xiàng)]
    （1）對(duì)照設(shè)置：實(shí)驗(yàn)對(duì)照的設(shè)置應(yīng)包括能與免疫抗體共沉淀的樣品和能與非免疫抗體共沉淀的樣品。通過(guò)兩者比較可以鑒別抗體所形成的特異性條帶和非特異性條帶（例如，來(lái)自于重鏈的條帶）。此外還應(yīng)該包括含有已知的或標(biāo)準(zhǔn)量的待測(cè)抗原的陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性對(duì)照可以是含有已知或標(biāo)準(zhǔn)量待測(cè)抗原的任何樣品，來(lái)源于細(xì)菌或桿狀病毒超常表達(dá)系統(tǒng)或來(lái)源于已充分鑒定的細(xì)胞系。該樣品不必經(jīng)過(guò)免疫沉淀但應(yīng)在臨近的膠道和其他樣品同時(shí)上樣電泳。這樣能夠提示免疫印跡是否成功，并對(duì)抗原的相對(duì)分子量進(jìn)行比較。如果陽(yáng)性對(duì)照中抗原的量是已知的，可粗略估計(jì)待測(cè)樣品中抗原的含量。
    （2）常見(jiàn)問(wèn)題與解決方法：有一個(gè)值得注意的問(wèn)題，將免疫沉淀制備的蛋白用于免疫印跡時(shí)，來(lái)自免疫沉淀的抗體會(huì)出現(xiàn)在印跡膜上。該抗體可被二抗試劑檢出。通常抗體重鏈和輕鏈的大小并不干擾待測(cè)抗原的鑒定。然而，若待測(cè)抗原的大小在50kD或25kD左右（大約為重鏈和輕鏈多肽的大?。?，則難以對(duì)待測(cè)抗原進(jìn)行鑒定。出現(xiàn)這種情況，有兩種解決辦法：一是可將免疫沉淀抗體共價(jià)結(jié)合在A蛋白或C蛋白微珠上；其二是采用直接檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行測(cè)定。

蛋白質(zhì)凝膠電泳

    聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），是目前對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、純度鑒定及分子量測(cè)定的主要方法之一。十二烷基磺酸鈉（SDS）是一種陰離子去污劑，可與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性并帶上大量負(fù)電荷。SDS-PAGE是zui常用的凝膠電泳技術(shù)。它通常采用不連續(xù)電泳系統(tǒng)，即用上層膠（成層膠）和下層膠（分離膠）兩種不同濃度的凝膠灌制凝膠板，見(jiàn)圖2.SDS-PAGE通過(guò)其電荷效應(yīng)、濃縮效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到蛋白質(zhì)高分辨率的分離效果。

圖2 SDS-PAGE凝膠分層示意圖

    待分離蛋白質(zhì)樣品在電泳中的泳動(dòng)速度，或相對(duì)遷移率（Mr）與蛋白質(zhì)本身性質(zhì)（如分子大?。?、凝膠孔徑和電泳條件（如電流、電壓）等密切相關(guān)，蛋白質(zhì)結(jié)合大量的SDS后，各組分之間的的形狀和電荷差異被抵消，此時(shí)蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中泳動(dòng)速度的快慢，僅與各自分子量的大小有關(guān)。因此，可根據(jù)下列公式計(jì)算分子量大小:

lgMW=lgK—bMr

    其中，MW為蛋白質(zhì)的分子量，K為常數(shù)，Mr為相對(duì)遷移率，b為斜率。將已知分子量的幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在電泳中的相對(duì)遷移率對(duì)其分子量的對(duì)數(shù)做圖，即可得到一條蛋白質(zhì)分子量校正曲線(xiàn)。根據(jù)待測(cè)樣品的相對(duì)遷移率，可由校正曲線(xiàn)查到其分子量大小，蛋白質(zhì)樣品中加SDS煮沸后，蛋白質(zhì)發(fā)生變性，為保護(hù)和還原二硫鍵，尚需加還原劑2-巰基乙醇（2-ME）或二硫蘇糖醇（DTT）。蛋白質(zhì)變性使亞基聚合形式存在的蛋白質(zhì)解聚成單個(gè)亞基。因此，對(duì)于一個(gè)純化蛋白質(zhì)，可經(jīng)SDS-PAGE確定其亞基種類(lèi)、數(shù)目及大小。上述蛋白質(zhì)分子量測(cè)定更確切地說(shuō)是蛋白質(zhì)分子各亞基分子量的大小。

    丙烯酰胺凝膠孔徑對(duì)電泳速度及分離效果影響很大。凝膠孔徑的大小取決于丙烯酰胺（Aery）單體及N，N—亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）的含量及比例。總膠濃度（T）可在3％～30％范圍內(nèi)變動(dòng)，T為8％～15％的凝膠，適用于大多數(shù)蛋白質(zhì)樣品的分離。交聯(lián)度（C）是反映凝膠聚合情況的一個(gè)指標(biāo)。凝膠聚合過(guò)程中，Acry單體之間形成延伸的多聚鏈，并通過(guò)Bis的作用，連接和交叉成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，zui終成為肉眼可見(jiàn)的凝膠。催化劑過(guò)硫酸銨（APS）和加速劑四甲基己二胺（TEMED）直接影響凝膠聚合質(zhì)量。二者加量過(guò)多，會(huì)使Acry單體聚合鏈較短，聚合不充分，膠的脆性增加；反之，如加量過(guò)少，則聚合速度大大降低，甚至只出現(xiàn)所配制的膠溶液黏度稍增加、無(wú)膠狀物出現(xiàn)的現(xiàn)象。見(jiàn)圖3.

圖3 相對(duì)遷移率與分子量對(duì)數(shù)關(guān)系簡(jiǎn)圖

    根據(jù)電泳的目的和要求及樣品的特點(diǎn)，可采取恒流或恒壓條件進(jìn)行電泳。
    由于印跡技術(shù)需將蛋白質(zhì)成功地從膠中轉(zhuǎn)移至膜上，因此，選擇合適的凝膠甚為重要。一般情況下，丙烯酰胺和交聯(lián)劑的比例越低，轉(zhuǎn)移就越易進(jìn)行。超薄膠轉(zhuǎn)移的速度快，而且*。通常，應(yīng)根據(jù)目的選擇厚度、大小均適合的凝膠。若想尋求蛋白質(zhì)的*分辨力，長(zhǎng)膠的效果較好，使較大分子量的蛋白質(zhì)更好地分離。若想達(dá)到zui大的靈敏度，膠的厚度可增加到1.5mm，并且在不發(fā)生變形的前提下，盡量提高蛋白的上樣量。若主要考慮的是分離速度，則選用微型膠，厚度為0.5mm。表1顯示SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍。

表1 SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍

試劑與器材

    （1）Acry／Bis貯存液：29.2gAcry，0.8gBis，加60m1雙蒸水充分溶解后，再加雙蒸水至100ml。過(guò)濾后，于4℃避光保存。
    （2）分離膠緩沖液：1.5mol／L Tris-HCl，pH8.8：18.15g Tris，溶于60ml雙蒸水中，用1mol/L HCl調(diào)pH至8.8，加雙蒸水至100ml，于4℃保存。
    （3）成層膠緩沖液：0.5mol／L Tris-HCl，pH6.8：6.0g Tris，溶于60ml雙蒸水中，用 1mol／LHCl調(diào)pH至6.8，加雙蒸水至100ml，于4℃保存。
    （4）10％APS：1.0g APS加10ml雙蒸水溶解，一20℃分裝凍存，或新鮮配制。
    （5）TEMED：原液。
    （6）10％SDS：10g SDS溶于80m1雙蒸水中，加熱攪拌至*溶解，定容至100ml。室溫保存。
    （7）50％甘油：50ml甘油加50ml雙蒸水，配成100ml溶液。
    （8）樣品緩沖液（6X）：成層膠緩沖液1.Oml，50％甘油0.8ml，10％SDS 1.6ml，2-ME0.4ml，0.05％溴酚藍(lán)0.2ml，雙蒸水4.0ml?；旌暇鶆蚝螅盅b凍存。
    （9）電極緩沖液（1X）：pH8.3：3.03g Tris，14.4g甘氨酸，1.0g SDS，加雙蒸水至1000ml。
    （10）蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)晶：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（高分子量和低分子量）均有商品供應(yīng)。
    （11）垂直板電泳裝置：電泳槽（JM—250型，大連）。
    （12）電泳儀。
    （13）玻璃微量進(jìn)樣器：加樣槍配扁而長(zhǎng)的加樣頭亦可。

操作步驟 【動(dòng)畫(huà)】

    （1）將兩塊玻璃扳組成的灌膠模具（其中一塊上口帶有凹槽，另一塊內(nèi)面兩側(cè)粘有凝膠板隔離膠條，膠條厚度為0.5mm、0.75mm、1.0mm，按所需凝膠厚度選擇）洗凈、晾干，按圖4安裝好。

圖4 灌膠模具安裝示意圖

    （2）選擇合適的分離膠濃度，按表2配制所需分離膠溶液。

表2 分離膠溶液配方

    （3）將分離膠液混合后緩慢倒入玻璃板之間，并即刻在膠表面用滴管沿凝膠板內(nèi)壁滴加2～3mm高的水飽和正丁醇（無(wú)水乙醇亦可），以防止空氣中的氧擴(kuò)散進(jìn)入膠液，影響聚合（膠液與正丁醇分界面可見(jiàn)清晰的折光線(xiàn)）。
    （4）待分離膠聚合后（約30～40分鐘），傾去表面液體，用少量分離膠緩沖液洗2～3次，多余的液體用濾紙條吸干。
    （5）配制成層膠緩沖液：3.05ml雙蒸水，0.65ml Acry／Bis液，1.25ml成層膠緩沖液，50μl 10％SDS 50μl 10％APS，5μl TEMED?？傮w積5.0ml，T為4％。
    （6）將成層膠液混合后，緩慢加到分離膠表面，至凹口玻璃板上緣。小心插入梳子（梳子應(yīng)在步驟1安裝完畢后，預(yù)先試一下是否合適），注意排除氣泡。
    （7）30分鐘至1小時(shí)后，小心拔出梳子，去掉四周封閉乳膠管，將凝膠板與上、下電泳槽連接好。
    （8）上層電泳槽中加電極緩沖液沒(méi)過(guò)加樣孔，并用電極緩沖液沖洗加樣孔。如個(gè)別孔發(fā)生扭曲，可將玻璃微量進(jìn)樣器針頭插入孔中，把孔間的短膠柱推正。
    （9）待測(cè)蛋白質(zhì)溶液中按1：4比例加樣品緩沖液，如為沉淀及凍干粉，樣品緩沖液應(yīng)稀釋4～5倍后加入，并使樣品充分溶解。蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)按商品說(shuō)明書(shū)處理。沸水浴中煮3～5分鐘后上樣。
    （10）恒壓電泳。樣品在成層膠中泳動(dòng)時(shí)，電壓為100V，進(jìn)入分離膠后，電壓增至150～200V（約15V／em）。為防止電泳產(chǎn)熱過(guò)多，應(yīng)外接冷卻水裝置。
    （11）當(dāng)樣品緩沖液中的溴酚藍(lán)指示劑移至凝膠底部時(shí)，終止電泳（約3小時(shí)左右）。取出凝膠板，小心將兩板之間的膠移至較大的表面皿中。此凝膠可直接進(jìn)行染色觀察；亦可進(jìn)一步通過(guò)免疫印跡技術(shù)，對(duì)待測(cè)蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。

注意事項(xiàng)

    （1）分離膠中加入少量甘油可增加膠的柔韌性，使膠不易破裂。
    （2）配制膠液時(shí)，zui后加APS和TEMED，加入后即刻使膠液充分混合，但要防止劇烈搖晃而產(chǎn)生氣泡。
    （3）表中所加試劑的量是依據(jù)灌制面積為14cm×l4cm，厚度為1mm的凝膠而設(shè)定，其他規(guī)格的凝膠板試劑用量可參考此表，進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。
    （4）Acry、Bis具有神經(jīng)毒性，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)帶手套操作。
    （5）可選用恒流條件進(jìn)行電泳，如：樣品在成層膠中泳動(dòng)時(shí)，電流為30mA，進(jìn)入分離膠后，電流增加至40mA；亦可以4～5mA低電流，電泳過(guò)夜，次日增加電流至10～12mA 5～10分鐘，以改善樣品的少量擴(kuò)散。
    （6）待分離樣品的質(zhì)、量直接影響電泳效果，如：若電泳出現(xiàn)波浪線(xiàn)，則說(shuō)明上樣量過(guò)多，應(yīng)減少上樣量；若樣品中含鹽濃度過(guò)高，應(yīng)先透析，以便除掉鹽分；若樣品黏度過(guò)大（如細(xì)胞蛋白質(zhì)），先用超聲波破碎染色體DNA后再電泳。
    （7）如果待分離樣品中蛋白質(zhì)組分分子量的變化幅度大，則應(yīng)考慮用梯度發(fā)生器制備5％～20％的梯度膠，以達(dá)到滿(mǎn)意的分離效果。
基本原理 【動(dòng)畫(huà)】

    電泳后蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移的方法，包括半干式轉(zhuǎn)移、濕式轉(zhuǎn)移等。各種轉(zhuǎn)移方法原理相似，都是將膜與膠放在中間，上下加濾紙數(shù)層，做成"Sandwich”樣的轉(zhuǎn)移單位，并且保證帶負(fù)電的蛋白質(zhì)向陽(yáng)極轉(zhuǎn)移，即膜側(cè)連接陽(yáng)極或面向陽(yáng)極（連接方式如圖5所示）。

圖5 轉(zhuǎn)移單位示意圖

    可用于免疫印跡的固相載體有多種，硝酸纖維素膜、尼龍膜、帶正電荷的尼龍膜及PVDF（聚亞乙烯雙氧化物）膜。硝酸纖維素膜zui為常用，具有結(jié)合能力強(qiáng)，膜不需要活化，背景淺，能進(jìn)行多次免疫檢測(cè)并可用常規(guī)染色方法，功能基團(tuán)壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，但極易破碎不易操作。尼龍膜軟且結(jié)實(shí)，較硝酸纖維素膜易操作，具有與蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-去污劑混合物有很高的結(jié)合力，每平方厘米可結(jié)合480pg蛋白（而硝酸纖維素膜只能結(jié)合80Pg），因此靈敏度高，背景也高，因?yàn)槠涓唠姾擅芏仁箤?duì)其非結(jié)合區(qū)進(jìn)行封閉較為困難。帶正電荷的尼龍膜能有效地結(jié)合低濃度的小分子蛋白，酸性蛋白、糖蛋白和蛋白多糖，當(dāng)轉(zhuǎn)印液中有SDS時(shí)，蛋白質(zhì)容易從膜上泄漏，用甲醇固定能提高蛋白質(zhì)在尼龍膜上的保留指數(shù)。PVDF膜在制備多肽供蛋白質(zhì)化學(xué)分析中zui為常用。在進(jìn)行蛋白水解和序列分析時(shí)，通常是先將蛋白質(zhì)結(jié)合在PVDF膜上。

    將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至膜上的方法很多。目前常用方法是電洗脫或電印跡。其主要優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)印迅速、*。電洗脫有兩種方法：一種是濕轉(zhuǎn)印法，即將凝膠-膜夾層組合*浸入轉(zhuǎn)印緩沖液中；另一種是半干轉(zhuǎn)印法，即將凝膠-膜夾層組合放在浸有轉(zhuǎn)印緩沖液的吸水紙之間。前者是將夾層組合放人有鉑絲電極的緩沖液槽中。而后者是將凝膠-膜夾層組合置于兩個(gè)石墨平板電極之間。這兩種轉(zhuǎn)印的裝置效果均較好，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件來(lái)選擇。

試劑與器材

    （1）電泳凝膠。
    （2）轉(zhuǎn)移緩沖液：pH8.1—8.4：3.03g Tris，14.4g甘氨酸，200ml甲醇充分溶解后，加雙蒸水定容至1000ml。
    （3）TBS緩沖液：1.21g Tris，8.77gNaCl，加HCl調(diào)pH至7.4，加水定容至1000ml。
    （4）TTBS緩沖液：在TBS中加入Tween—20，濃度為0.1％，4℃保存1個(gè)月。
    （5）封閉液：1.5g脫脂奶粉溶于50ml TTBS中，現(xiàn)用現(xiàn)配（用1％～3％的BSA，或10％胎牛血清亦可）。
    （6）特異單克隆抗體：用封閉液適當(dāng)稀釋。
    （7）酶標(biāo)第二抗體：辣根過(guò)氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AKP）標(biāo)記。
    （8）蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印膜：NC（硝酸纖維素）膜、PVDF（聚偏二氟乙烯）膜，或尼龍膜等均可。
    （9）顯色底物。
    （10）恒溫振蕩器。
    （11）半干式電泳凝膠轉(zhuǎn)移儀。
    （12）Whatman 3mm濾紙。
    （13）手套。
    （14）孵育及顯色用塑料盒。
    （15）塑料袋。
    （16）塑料封口機(jī)

操作步驟（半干式轉(zhuǎn)移）

    1.轉(zhuǎn)移
    （1）電泳后的凝膠先切除成層膠及需要進(jìn)行凝膠直接染色的孔道部分，并將膠剪一小角作為定位標(biāo)記，然后放在轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡30分鐘左右。
    （2）將轉(zhuǎn)印膜1張及6張Whatman濾紙剪成與膠同樣大小。轉(zhuǎn)印膜用前需在轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10～15分鐘，濾紙用前在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸濕即可。
    （3）由下至上將3層濾紙、膜、凝膠及3層濾紙依次放好。每放一層都應(yīng)注意排除氣泡。如有氣泡，可用光滑的玻璃棒或試管在各表面緩慢滾動(dòng)，予以排除。
    （4）將轉(zhuǎn)移裝置連接好，接通電源。恒流下轉(zhuǎn)移，0.8mA／cm2，轉(zhuǎn)移30分鐘至1小時(shí)。
    （5）關(guān)閉電源，取出膜，然后用雙蒸水漂洗l～2分鐘，放在濾紙中干燥備用。注意膜上要做好標(biāo)記。

    2．檢測(cè)
    （1）將膜放在塑料盒中，加入適量封閉液，于37℃恒溫振蕩器上放置1小時(shí)，或4℃過(guò)夜。
    （2）將膜轉(zhuǎn)入塑料袋中，加入用封閉液稀釋的*抗體，于37℃或室溫孵育反應(yīng)1小時(shí)。
    （3）剪開(kāi)塑料袋，傾去*抗體液體，用鑷子將膜移至塑料盒中，加TBS洗3次，每次15分鐘。
    （4）加入稀釋好的酶標(biāo)第二抗體，繼續(xù)在37℃或室溫孵育反應(yīng)30分鐘至1小時(shí)。
    （5）同步驟（3），洗膜。
    （6）加底物顯色液。此步驟一般要求避光進(jìn)行。即時(shí)檢查一下，以控制顯色程度，防止本底過(guò)高及出現(xiàn)非特異條帶。
    （7）終止反應(yīng)，用雙蒸水大量沖洗，然后將膜放于雙層濾紙中干燥保存。

注意事項(xiàng)

    （1）如采用PVDF膜，使用前應(yīng)在甲醇中浸泡一下，再移至轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡。另外，PVDF膜在檢測(cè)時(shí)，采用TTBS緩沖液。
    （2）電泳凝膠一般可重復(fù)轉(zhuǎn)移1次，以獲得兩張相同的膜，第2次轉(zhuǎn)移的時(shí)間可略延長(zhǎng)。
    （3）如待分析的蛋白質(zhì)分子量大，轉(zhuǎn)移時(shí)間也需延長(zhǎng)。
    （4）上述顯色檢測(cè)方法僅給出了基本步驟，采用不同檢測(cè)系統(tǒng)，需按廠(chǎng)家說(shuō)明書(shū)具體操作。
    （5）電泳轉(zhuǎn)移操作時(shí)，保證濾紙、膜、凝膠其間無(wú)氣泡存在是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟。因即或有微小的氣泡殘留，電泳時(shí)局部溫度升高，氣泡膨脹會(huì)嚴(yán)重影響印跡結(jié)果。

轉(zhuǎn)印后切取印跡膜

   有時(shí)轉(zhuǎn)印后需將印跡剪成較小的片狀進(jìn)行單獨(dú)處理。單個(gè)泳道可以泳動(dòng)同一樣品，待彼此分開(kāi)后，可用不同的抗體并列檢測(cè)。如以電泳方向剪膜，就可在同一樣品中檢測(cè)不同分子大小的抗原。為了簡(jiǎn)便而地找到泳道，電泳之后用麗春紅S（Ponceaus S）或印度墨汁對(duì)印跡膜進(jìn)行染色，便可很快確定待測(cè)蛋白質(zhì)的位置并將其剪下。表3表明兩種染料的適用范圍及優(yōu)缺點(diǎn)，用麗春紅S染色的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，價(jià)廉和具有可逆性，在封閉過(guò)程中，染色易消褪，且不干擾進(jìn)一步的檢測(cè)。

    在某些情況下，可能想用印跡中的較高分子量區(qū)域來(lái)檢測(cè)一種抗原，用另一個(gè)區(qū)域來(lái)檢測(cè)另一不同分子量的蛋白質(zhì)。為了使印跡中不同的區(qū)域正好對(duì)應(yīng)于相應(yīng)分子量的范圍，這需要在對(duì)照泳道中加入已知分子量的蛋白質(zhì)。這樣可方便地在印跡中找到適當(dāng)?shù)膮^(qū)域并將其剪下。

    使用預(yù)染的分子量標(biāo)記，可為轉(zhuǎn)印后切下所需印跡提供良好的指示，此類(lèi)標(biāo)記已商品化，但是比麗春紅S染色法昂貴。標(biāo)記中的顏色除了增加成本對(duì)實(shí)驗(yàn)并無(wú)不良影響，而且在泳動(dòng)時(shí)非常漂亮。

表3 用于免疫印跡染色的染料

印跡膜蛋白染色

    [所需試劑]
    （1）2％麗春紅S濃貯存液（3-羥基-4-[2-磺基-4-硫代-苯偶氮基]-2，7—萘二磺酸）：溶于30％三氯醋酸和30％磺基水楊酸中。貯存液可在室溫下穩(wěn)定存放1年以上。
    （2）PBS。

    [操作步驟]
    （1）在染色之前，先配制麗春紅S的應(yīng)用液。即將2％的麗春紅S濃貯存液用1％醋酸1:10稀釋即成為應(yīng)用液（注意：如果使用硝酸纖維膜，須將麗春紅S應(yīng)用液更換為用水1:10稀釋?zhuān)?br />     （2）用麗春紅S應(yīng)用液將PVDF膜洗1次。
    （3）加入新鮮稀釋的麗春紅S應(yīng)用液，并在室溫下攪動(dòng)5～lOmin。
    （4）將PVDF膜放人PBS中漂洗數(shù)次，每次1～2min，并更換PBS。
    （5）根據(jù)需要將轉(zhuǎn)印部位和分子量標(biāo)準(zhǔn)位置進(jìn)行標(biāo)記，至此PVDF膜可用于封閉和加入抗體。

 

    免疫檢測(cè)主要取決于抗原抗體的特異性，特別是能夠識(shí)別膜上變性的和固定化抗原的抗體。因印跡膜上有非特異性吸附蛋白質(zhì)的位點(diǎn)，因此需進(jìn)行封閉以防免疫試劑的非特異性吸附。將印跡膜與一定濃度的不參與特異性反應(yīng)蛋白質(zhì)或去污劑溶液孵育可實(shí)現(xiàn)封閉。然后通過(guò)抗體與膜上抗原的特異性結(jié)合來(lái)定位抗原?？乖捎靡子^察的標(biāo)記的抗體進(jìn)行檢測(cè)?？贵w本身可以標(biāo)記，直接用于檢測(cè)抗原，但更為常見(jiàn)的是，使用的抗體是非標(biāo)記的，而用標(biāo)記的二抗采進(jìn)行抗原定位。

    常用的標(biāo)記方法有酶聯(lián)法，一般是用辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶，具體的介紹見(jiàn)本書(shū)第四章“免疫標(biāo)記技術(shù)”。近年來(lái)，化學(xué)發(fā)光（CL）法已成為常用的方法之一。該法是基于環(huán)化二脂酰肼（cyclic diocyhydrazide）的化學(xué)氧化作用，生成一種不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物，當(dāng)其衰變時(shí)即可發(fā)光。發(fā)出的光可使標(biāo)準(zhǔn)X-光片感光，產(chǎn)生較易識(shí)別的圖像?；瘜W(xué)發(fā)光法比過(guò)去使用的顯色或放射活性檢測(cè)法更加靈敏。盡管對(duì)靈敏度增加的幅度還有很多爭(zhēng)論，但一般認(rèn)為比顯色法大約增加20倍，比放射活性檢測(cè)方法約增高 7倍。該法的關(guān)鍵是使用了辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)物作為二抗或二級(jí)試劑。辣根過(guò)氧化物酶可與抗免疫球蛋白抗體、蛋白A、蛋白C或其他可與一抗特異結(jié)合的試劑共價(jià)結(jié)合。在*存在的條件下，過(guò)氧化物酶催化魯米諾（氨基苯二酰一肼）氧化后即可發(fā)光。

    除了蛋白質(zhì)樣品的電泳分離過(guò)程之外，在進(jìn)行免疫印跡操作之前，還考慮下面兩個(gè)問(wèn)題。

印跡膜上非特異性蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的封閉

    表4 總結(jié)了常用的封閉液及其優(yōu)缺點(diǎn)。盡管這些封閉液在某些情況下使用較為滿(mǎn)意，但是仍需要仔細(xì)選擇以確保其能適合于檢測(cè)試劑。幾乎適合于所有檢測(cè)系統(tǒng)的兩種封閉緩沖液是脫脂奶粉和牛血清白蛋白。若蛋白質(zhì)封閉液造成本底過(guò)高或干擾檢測(cè)，則可試用吐溫20封閉液。

表4 常用的封閉液

*若不愿每次新鮮配制封閉緩沖液，應(yīng)加入0.01%硫柳汞制劑作為防腐劑。避免使用*，因其能抑制辣根過(guò)氧化物酶的活性。
 

直接與間接檢測(cè)方法

    直接法是指用標(biāo)記的*抗體（一抗）來(lái)進(jìn)行檢測(cè)的方法，用這種類(lèi)型的抗體對(duì)膜上抗原進(jìn)行免疫檢測(cè)的本底較低，并且在同一張印跡膜上可同時(shí)使用來(lái)源或特異性不同的多種抗體，但靈敏度不如間接法。間接檢測(cè)是指先使用非標(biāo)記的一抗，然后用可與一抗結(jié)合的標(biāo)記第二抗體（二抗）進(jìn)行檢測(cè)的方法。由于二抗分子是多價(jià)的，具有放大效應(yīng)，因而靈敏度較高。因此，除非需要直接檢測(cè)抗原的特異性，否則是選擇間接法進(jìn)行免疫印跡測(cè)定。通常選用與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗免疫球蛋白抗體商品試劑來(lái)檢測(cè)一抗，分別針對(duì)不同種屬來(lái)源的一抗。這樣，一個(gè)實(shí)驗(yàn)室只需備用針對(duì)小鼠，大鼠，家兔和其他一抗的少數(shù)幾種通用試劑即可滿(mǎn)足各種免疫印跡實(shí)驗(yàn)要求。

    下面以間接檢測(cè)法為例介紹免疫檢測(cè)的方法。

間接檢測(cè)法 

    [準(zhǔn)備工作]
    在準(zhǔn)備做抗原檢測(cè)時(shí)，須考慮所用一抗和二抗的*濃度，對(duì)不同來(lái)源的抗體，其特異性林的濃度都不相同。因此，對(duì)一抗體進(jìn)行滴定有助于確定*反應(yīng)比例，預(yù)先滴定二抗對(duì)實(shí)也有幫助，一旦確定*濃度，則每次印跡即可用同一批一抗、二抗來(lái)完成。多數(shù)情況下可用商家提供的濃度進(jìn)行檢測(cè)。

    [材料與試劑]
    （1）PBS：稱(chēng)取8g NaCl；0.2gKCl；1.44g Na2HP04和0.24g KH2PO4，加蒸餾水800ml，用HCl調(diào)節(jié)溶液pH值至7.4，加水至1L，在1.034X105Pa高壓下蒸氣滅菌20min，室溫保存。
    （2）封閉液（見(jiàn)表4）。
    （3）1%BSA/PBS。
    （4）一抗試劑和堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗試劑（通常是用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體）。
    （5）堿性磷酸酶底物溶液:
        1）NBT（氮藍(lán)四唑）溶液:在10ml 70%的而甲基酰胺中溶解0.5gNBT。
        2）BCIP（5-溴-4-氮-3-吲哚磷酸）溶液:在10ml 70%的而甲基酰胺中溶解0.5g BCIP。
        3）堿性磷酸酶緩沖液：100mmol／LNaCl；5mmol／L MgCl2；100mmol／L Tris-HCl（pH9.5），置密閉容器中保存，此溶液穩(wěn)定。
        4）取66rdNBT溶液與10ml堿性磷酸酶緩沖液混勻，加入33plBCIP溶液。
        5）辣根過(guò)氧化物酶底物溶液：用9ml的0.01mol／L Tris-Cl（pH7.6）溶液中溶解6mg 3—3，—二氨基聯(lián)苯胺，加入lml 0.3％（w／v）NiCl2或CoCl2，用Whatmanl號(hào)濾紙過(guò)濾以除去沉淀，加入10yB0％H202混勻后立即使用。此溶液須在臨用時(shí)配制。

    [操作方法]
    （1）用PBS漂洗印跡膜數(shù)次。
    （2）加入一種封閉液（見(jiàn)表4）。注意：不同的抗原和實(shí)驗(yàn)方法需用不同的封閉緩沖液。例如，BSA（V部分）和牛奶都含有磷酸化的酪氨酸和生物素，用特異性抗磷酸化酪氨酸抗體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，這會(huì)給解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成一定的混淆，也給親合素／鏈霉親合素檢測(cè)的應(yīng)用帶來(lái)一些問(wèn)題。某些牛奶制品可抑制堿性磷酸酶的活性。若無(wú)信號(hào)或檢測(cè)背景較高，則需嘗試不同的封閉緩沖液。
    （3）室溫下攪動(dòng)孵育。一般孵育20min～2h或4℃過(guò)夜較好。
    （4）從封閉緩沖液中取出印跡膜，用PBS漂洗3次，每次5min。
    （5）加入工作濃度的一抗溶液。每張15X15cm的印跡膜用量為10ml。所有的稀釋液均用含有蛋白質(zhì)的溶液，例如1％BSA／PBS。孵育可在淺盤(pán)或塑料袋中進(jìn)行。在室溫下將抗體和印跡膜攪動(dòng)孵育至少1h。有人認(rèn)為4℃孵育過(guò)夜（12～18h）可提高靈敏度。
    （6）用PBS漂洗印跡膜4次，每次換液洗5min。 ，
    （7）此時(shí)，印跡膜便可加人工作濃度的標(biāo)記的二抗溶液?？稍跍\盤(pán)或塑料袋中室溫孵育1h。抗體用含有蛋白質(zhì)的溶液進(jìn)行稀釋?zhuān)?1％BSA／PBS。商品化的酶標(biāo)二抗應(yīng)在0.5～5μl／ml濃度之間使用（通常將商品試劑原液稀釋成1：200～1:2000的應(yīng)用液）。用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的試劑
須用不含疊氮鈉的封閉液稀釋。
    （8）用PBS漂洗印跡膜4次，每次換液洗5min。
    （9）將經(jīng)漂洗的印跡膜移至另一干凈淺盤(pán)中，按印跡膜面積加入0.lml／cm2的底物溶液（若使用堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗，用堿性磷酸酶底物溶液，若用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗則用辣根過(guò)氧化物酶底物溶液），于室溫輕輕搖動(dòng)，待蛋白條帶的顏色深度達(dá)到要求（約2-20min），用水略為漂洗，放人PBS中。
    （10）拍攝照片，留作*實(shí)驗(yàn)記錄（過(guò)氧化物酶染色的蛋白條帶經(jīng)日光照射數(shù)小時(shí)后顏色將退去）。
 

抗體的性質(zhì)

    影響免疫印跡成敗的一個(gè)主要因素是抗原分子中可被抗體識(shí)別的表位的性質(zhì)。只有那些能識(shí)別耐變性表位的抗體可與抗原結(jié)合。多數(shù)多克隆抗血清中或多或少地含有這種類(lèi)型的抗體，所以在免疫印跡實(shí)驗(yàn)中常選用多克隆抗體。相反，許多單克隆抗體不能與變性抗原反應(yīng)，因?yàn)樗R(shí)別的表位依賴(lài)于抗原蛋白正確折疊所形成的三維空間構(gòu)象。表5顯示各種抗體的優(yōu)缺點(diǎn)。

表5 抗體的選擇

 

 

 

 

印跡法操作流程

印跡法實(shí)驗(yàn)?zāi)l 溫育槽
樣品緩沖液 加樣 : 1.5ml/ 槽 *
溫育 : 搖擺搖床上振蕩 5 分鐘 *
吸干 *
已稀釋的樣本 加樣 : 1.5ml/ 槽
溫育 : 搖擺搖床上振蕩 30 分鐘
清洗緩沖液 清洗 : 1.5ml 緩沖液 溫育 5 分鐘 吸干
酶結(jié)合物 加樣 : 1.5ml/ 槽
溫育 : 搖擺搖床上振蕩 30 分鐘
清洗緩沖液 清洗 : 1.5ml 緩沖液 溫育 5 分鐘 吸干
色原 / 底物液 加樣 : 1.5ml/ 槽
溫育 : 搖擺搖床上振蕩 10 分鐘
清洗 : 蒸餾水浸洗 吸干
結(jié)果判斷 : 肉眼判斷結(jié)果