在生物制藥質(zhì)量控制（QC）放行檢測(cè)中，活性檢測(cè)（Potency Assay）是衡量產(chǎn)品批間一致性、確保療效的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)ELISA方法雖然經(jīng)典，但其繁瑣的洗滌步驟、較長(zhǎng)的操作周期以及較高的變異系數(shù)，始終困擾著QC實(shí)驗(yàn)室的效率和數(shù)據(jù)可靠性。而瑞孚迪（Revvity）的均相時(shí)間分辨熒光(Homogeneous Time-Resolved Fluorescence, HTRF) 的技術(shù)正在悄然改變這一局面。

HTRF技術(shù)憑借其免洗、高靈敏、高通量、信號(hào)穩(wěn)定和易于自動(dòng)化等核心優(yōu)勢(shì)，正在成為生物制藥QC放行檢測(cè)中不可忽視的利器。從單克隆抗體到融合蛋白，從胰島素類似物到復(fù)雜生物制品，大量研究已證實(shí)HTRF方法在專屬性、準(zhǔn)確性、精密度和線性等方面藥典驗(yàn)證要求，且結(jié)果與傳統(tǒng)ELISA等效甚至更優(yōu)。

HTRF技術(shù)原理

HTRF是一種結(jié)合了時(shí)間分辨熒光（TRF）與熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的均相檢測(cè)技術(shù)。

在HTRF體系中，使用鑭系元素（如銪Eu3?、鋱Tb3?）的穴狀化合物作為熒光供體，其熒光壽命長(zhǎng)達(dá)毫秒級(jí)，遠(yuǎn)超普通熒光染料的納秒級(jí)。檢測(cè)時(shí)，通過(guò)設(shè)定幾十微秒的時(shí)間延遲，短壽命的背景熒光信號(hào)幾乎衰減，而長(zhǎng)壽命的供體熒光信號(hào)得以被精確捕捉，從而顯著提高信噪比。

當(dāng)供體（鑭系化合物）與受體（如XL665或d2染料）距離接近（<10 nm）時(shí)，供體的能量通過(guò)非輻射方式轉(zhuǎn)移至受體，激發(fā)受體發(fā)出特定波長(zhǎng)的熒光信號(hào)（如665 nm）。熒光信號(hào)強(qiáng)度與待測(cè)生物分子的結(jié)合或活性呈正相關(guān)，從而實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定量。

圖1. HTRF原理圖

HTRF與ELISA方法學(xué)對(duì)比

與傳統(tǒng)ELISA相比，HTRF在QC放行場(chǎng)景中的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在多個(gè)維度：

阿達(dá)木單抗結(jié)合活性的對(duì)比研究明確證實(shí)，HTRF法與ELISA法測(cè)得的結(jié)果等效，可以替代ELISA用于該類單抗的結(jié)合活性測(cè)定[1]。

圖2. HTRF檢測(cè)阿達(dá)木單抗結(jié)合活性原理

表1 HTRF檢HTRF與ELISA法測(cè)定同一批樣品的結(jié)果比較

表2 HTRF與ELISA法測(cè)定10批樣品的結(jié)果比較

HTRF在QC放行中的應(yīng)用案例

案例1：抗PD-1/PD-L1單抗藥物活性檢測(cè)

中檢院?jiǎn)慰故页晒Φ貥?gòu)建了抗PD-1/PD-L1單抗藥物活性檢測(cè)方法，其操作簡(jiǎn)便易行，專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確性和精密度良好，回收率在80%~120%范圍內(nèi)，總RSD為13%，線性相關(guān)系數(shù)在0.99以上，滿足測(cè)定的要求，可用于單抗藥物的活性檢測(cè)，也為其他單克隆抗體活性測(cè)定方法的建立提供參考[2]。

圖3. HTRF檢測(cè)PD-1/PD-L1原理

案例2：替度格魯肽生物學(xué)活性檢測(cè)

中檢院梁成罡團(tuán)隊(duì)建立了檢測(cè)替度格魯肽體外生物學(xué)活性的HTRF法，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性免疫法檢測(cè)細(xì)胞中cAMP的量，反映替度格魯肽對(duì)GLP-2R的激活作用。該方法準(zhǔn)確度高（相對(duì)偏倚：-2.946%~1.426%）、精密度好（GCV：3.228%~4.736%）、操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短，可用于替度格魯肽產(chǎn)品的質(zhì)量控制[3]。

圖4. HTRF檢測(cè)cAMP原理

案例3：德谷胰島素生物學(xué)活性檢測(cè)

中國(guó)藥科大學(xué)利用HTRF技術(shù)建立了德谷胰島素體外生物學(xué)活性檢測(cè)方法，依據(jù)2020版《中國(guó)藥典》四部通則9401、1431進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證（相對(duì)偏倚：?4.1%～?0.9%，GCV均小于11%，線性R2≥0.98），結(jié)果均符合方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則和生物檢定統(tǒng)計(jì)法規(guī)定。該方法可用于研發(fā)、過(guò)程控制、終產(chǎn)品放行及生物類似藥的研究，具有成為現(xiàn)有藥典標(biāo)準(zhǔn)方法替代方法的潛力[4]。

圖5. HTRF檢測(cè)德谷胰島素原理

HTRF在QC放行中的方法驗(yàn)證

上述案例表明，HTRF方法能夠滿足ICH Q2 R2等國(guó)際質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)CQA檢測(cè)的要求，涵蓋效價(jià)、純度及受體結(jié)合檢測(cè)等多個(gè)維度?！吨袊?guó)藥典》四部通則9401、1431為HTRF方法的驗(yàn)證提供了明確的指導(dǎo)框架，涵蓋專屬性、相對(duì)準(zhǔn)確性、精密度、線性和范圍等關(guān)鍵指標(biāo)的評(píng)估要求。在實(shí)際應(yīng)用中，HTRF方法驗(yàn)證通常包括以下關(guān)鍵指標(biāo)：

1. 專屬性：僅與目標(biāo)抗原或抗體發(fā)生反應(yīng)，無(wú)交叉反應(yīng)。

2. 相對(duì)準(zhǔn)確性：不同效價(jià)水平的相對(duì)偏倚在±20%范圍內(nèi)。

3. 精密度：不同效價(jià)水平的GCV不超過(guò)20%。

4. 線性與范圍：理論相對(duì)活性與實(shí)際測(cè)得相對(duì)活性的相關(guān)系數(shù)在0.98以上。

5. 穩(wěn)定性指示能力：可反映破壞性樣品的活性變化趨勢(shì)。

綜上，HTRF技術(shù)不僅在方法學(xué)上優(yōu)于傳統(tǒng)ELISA，更在實(shí)際QC放行場(chǎng)景中得到了中檢院等權(quán)機(jī)構(gòu)的驗(yàn)證支持。對(duì)于生物制藥企業(yè)QC部門而言，引入HTRF方法可有效縮短檢測(cè)周期、降低操作變異、提升通量與自動(dòng)化適配能力，同時(shí)滿足國(guó)內(nèi)外藥典的嚴(yán)格驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。隨著更多生物制品類型的方法學(xué)建立與推廣，HTRF有望逐步成為活性檢測(cè)的主流平臺(tái)技術(shù)，為生物藥質(zhì)量控制提供更高效、更可靠的解決方案。

- 參考文獻(xiàn) -

1. Chin Med Biotechnol,April 2022,Vol. 17,No. 2

2. Chin J Pharm Anal 2019,39(1)

3. Acta Pharmaceutica Sinica 2025, 60(1): 211?217

4. Acta Pharmaceutica Sinica 2024, 59(12): 3347?3353

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