豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAMs）原代分離 + 培養(yǎng) + 純化 + 鑒定的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，偏實(shí)驗(yàn)室實(shí)用版，適合做病毒感染、免疫功能、藥物篩選等實(shí)驗(yàn)。

一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1、試劑與耗材

無(wú)菌 PBS（不含鈣鎂，pH 7.2–7.4）

培養(yǎng)基：

RPMI 1640 + 10% 胎牛血清（FBS）+ 1% 雙抗（青霉素/鏈霉素）

可選：添加 2 mM L - 谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸鈉

75% 酒精、無(wú)菌紗布、止血鉗、手術(shù)剪、鑷子

50 mL 離心管、細(xì)胞篩（70 μm）、培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)板

注射器 + 留置針/灌洗管（或直接用粗針頭）

2、動(dòng)物與取材

推薦：3–6 周齡健康仔豬，無(wú)呼吸道癥狀

處死方式：頸靜脈放血或 CO? 窒息（按當(dāng)?shù)貍惱硪螅?/span>

無(wú)菌條件下迅速取肺臟，避免污染消化道內(nèi)容物

二、肺泡灌洗（核心步驟）

取出肺臟，用無(wú)菌 PBS 輕輕沖洗表面血跡，放入無(wú)菌培養(yǎng)皿。

找到主支氣管，用止血鉗夾住一側(cè)肺門，只灌洗一側(cè)肺（另一側(cè)可備用）。

用留置針/粗針頭插入主支氣管，用絲線或止血鉗固定，防止漏液。

用 50 mL 注射器吸取預(yù)冷無(wú)菌 PBS，緩慢注入肺內(nèi)，使肺充分膨脹。

每次灌洗量：30–50 mL/側(cè)肺

反復(fù)灌洗 3–5 次，直到回收液基本清亮

收集所有回收灌洗液于 50 mL 無(wú)菌離心管，置于冰上。

要點(diǎn)：

PBS 預(yù)冷（4℃）可減少細(xì)胞激活、提高存活率

輕柔操作，避免肺破裂導(dǎo)致污染

三、細(xì)胞收集與純化

灌洗液經(jīng) 70 μm 細(xì)胞篩過(guò)濾，去除組織塊、黏液。

4℃，3920 r/min（約 400 g），離心 10 min，棄上清。

用預(yù)冷 PBS 重懸沉淀，再次離心 10 min，棄上清。

用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)：

臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，活率應(yīng) > 90%

典型產(chǎn)量：1 頭仔豬可獲得 1×10?–5×10? 個(gè) PAMs

貼壁純化（關(guān)鍵）

將細(xì)胞懸液接種到培養(yǎng)瓶/板中，置于 37℃、5% CO? 培養(yǎng)箱。

孵育 1.5–2 h，讓巨噬細(xì)胞充分貼壁。

輕輕吸棄未貼壁細(xì)胞（主要是淋巴細(xì)胞、死細(xì)胞），用預(yù)熱 PBS 洗 1–2 次。

加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

此時(shí)貼壁細(xì)胞即為高度富集的 PAMs，純度通常 > 90%。

四、培養(yǎng)與傳代/凍存

1、常規(guī)培養(yǎng)

培養(yǎng)基：RPMI 1640 + 10% FBS + 雙抗

條件：37℃、5% CO?，飽和濕度

形態(tài)：貼壁后呈不規(guī)則多角形、星形，有偽足，胞質(zhì)豐富

2、傳代（原代 PAMs 不建議多次傳代）

PAMs 為終末分化細(xì)胞，增殖能力弱，一般只做原代或 1 代使用。

如需傳代：

棄培養(yǎng)基，PBS 洗 1 次

0.25% 胰酶 - EDTA 室溫消化 1–3 min（鏡下觀察細(xì)胞變圓）

加含血清培養(yǎng)基終止消化，吹打、離心、重懸接種

3、凍存

凍存液：90% FBS + 10% DMSO

密度：1×10? 個(gè)/mL 以上

程序降溫盒 → -80℃過(guò)夜 → 轉(zhuǎn)入液氮長(zhǎng)期保存

五、純度與活性鑒定（建議必做）

1、形態(tài)觀察

貼壁后呈不規(guī)則、伸展、有偽足的巨噬樣形態(tài)

無(wú)明顯成纖維樣或上皮樣細(xì)胞污染

2、吞噬實(shí)驗(yàn)（簡(jiǎn)單直觀）

加入熒光微球或墨汁顆粒，37℃孵育 1–2 h

洗去未吞噬顆粒，鏡下可見大量顆粒在胞內(nèi)

3、表面標(biāo)志物（流式/免疫熒光）

常用：CD14、CD68、MAC387、SWC3 等巨噬細(xì)胞標(biāo)志陽(yáng)性

可排除 T/B 細(xì)胞、粒細(xì)胞為主的污染

六、常見問(wèn)題與注意事項(xiàng)

1、細(xì)胞活率低

灌洗 PBS 要預(yù)冷、操作輕柔

盡量縮短從處死到灌洗的時(shí)間（<30 min）

2、污染嚴(yán)重

嚴(yán)格無(wú)菌操作，肺表面充分酒精消毒

培養(yǎng)基中可適當(dāng)提高雙抗?jié)舛龋ǘ唐冢?/span>

3、純度不高、雜細(xì)胞多

延長(zhǎng)貼壁時(shí)間至 2 h

貼壁后多洗 1–2 遍，棄懸浮細(xì)胞

4、細(xì)胞激活、狀態(tài)差

避免反復(fù)吹打、劇烈離心

血清質(zhì)量很關(guān)鍵，建議用批次驗(yàn)證的 FBS

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