Advanced DNA RNA 轉(zhuǎn)染試劑在 RAW264.7、THP-1 細(xì)胞中的高效應(yīng)用

—— 先天免疫 lncRNA 與 miRNA 功能研究實(shí)踐

一、文獻(xiàn)基礎(chǔ)與 ZETA life 轉(zhuǎn)染試劑應(yīng)用背景

本內(nèi)容基于發(fā)表于免疫領(lǐng)域期刊《Frontiers in Immunology》的前沿研究成果展開，文獻(xiàn) DOI：10.3389/fimmu.2020.581517。文章系統(tǒng)驗(yàn)證了 ZETA life 公司 Advanced DNA RNA 轉(zhuǎn)染試劑（貨號(hào)：AD600150）在巨噬細(xì)胞先天免疫機(jī)制研究中的應(yīng)用優(yōu)勢。該試劑可同步完成質(zhì)粒、siRNA、miRNA 模擬物 / 抑制劑的高效細(xì)胞遞送，適配 lncRNA、miRNA 介導(dǎo)的 ceRNA 調(diào)控通路相關(guān)全套功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，是單核 / 巨噬細(xì)胞非編碼 RNA 研究的理想轉(zhuǎn)染工具。

二、試劑應(yīng)用體系：靶細(xì)胞、轉(zhuǎn)染底物與標(biāo)準(zhǔn)化操作方案

（一）實(shí)驗(yàn)靶細(xì)胞

RAW 264.7：經(jīng)典小鼠巨噬細(xì)胞系，多用于小鼠源 lncRNA 初步功能探究；

THP-1：人單核細(xì)胞細(xì)胞株，經(jīng) PMA 誘導(dǎo)分化為人巨噬細(xì)胞，用于人源同源非編碼 RNA 功能驗(yàn)證，更貼合人體先天免疫研究場景。

（二）各類轉(zhuǎn)染核酸底物及實(shí)驗(yàn)用途

過表達(dá)質(zhì)粒 （1）Gm28309 過表達(dá)質(zhì)粒（Gm28309 (+)）：用于上調(diào) lncRNA Gm28309 表達(dá)，開展功能獲得型實(shí)驗(yàn)； （2）pGL3 熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒：構(gòu)建攜帶 Gm28309 野生型（WT）、突變型（Mut）片段，以及 kB-Ras2 mRNA 3'UTR 野生 / 突變序列的重組載體，為 ceRNA 分子相互作用驗(yàn)證提供雙熒光素酶報(bào)告檢測體系。

siRNA 干擾片段 構(gòu)建靶向 P3852、P33714 等 6 種候選 lncRNA 的特異性 siRNA，用于 lncRNA 敲低實(shí)驗(yàn)（功能缺失驗(yàn)證），全部 siRNA 序列詳見原文補(bǔ)充附表 Supplementary Table 1。

miRNA 功能調(diào)控試劑 （1）miR-3068-5p mimic：外源導(dǎo)入模擬 miRNA，提升細(xì)胞內(nèi) miR-3068-5p 水平，模擬其內(nèi)源生物學(xué)功能； （2）miR-3068-5p inhibitor：特異性拮抗細(xì)胞內(nèi)成熟 miR-3068-5p，阻斷其對下游靶基因的抑制作用。

（三）標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)染操作流程

實(shí)驗(yàn)采用 ZETA life Advanced DNA RNA 轉(zhuǎn)染試劑，將轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)?；?siRNA 核酸按照 1:1 體積比例充分混勻，制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物后加入細(xì)胞培養(yǎng)體系；轉(zhuǎn)染孵育 24 h 后收集細(xì)胞上清與細(xì)胞沉淀，開展炎癥因子檢測、蛋白免疫印跡、熒光素酶活性檢測、胞內(nèi)活菌計(jì)數(shù)等分子與細(xì)胞水平檢測，完整操作細(xì)則參照原文 Materials and Methods 章節(jié)。

三、依托該轉(zhuǎn)染體系獲得的核心實(shí)驗(yàn)結(jié)論

借助該高效轉(zhuǎn)染方案，本研究完整闡明 lncRNA Gm28309 在布魯氏菌感染誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥應(yīng)答中的調(diào)控通路，核心結(jié)論分為三大板塊：

1. lncRNA 調(diào)控 NLRP3 炎癥小體與巨噬細(xì)胞抗感染免疫

（1）敲低人源同源 lncRNA P33714 后，巨噬細(xì)胞 IL-1β、IL-18 炎癥因子分泌量顯著上升，同時(shí)可顯著抑制布魯氏菌在細(xì)胞內(nèi)的存活與增殖（原文圖 3）； （2）過表達(dá)小鼠 lncRNA Gm28309 能夠顯著抑制 NLRP3 炎癥小體活化，下調(diào) NF-κB 通路 p65 蛋白磷酸化水平，減少 IL-1β、IL-18 釋放，進(jìn)而促進(jìn)布魯氏菌實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)免疫逃逸（原文圖 4）。

2. ceRNA 分子互作機(jī)制驗(yàn)證

lncRNA Gm28309 具備內(nèi)源 miRNA 海綿（ceRNA）功能，可特異性吸附結(jié)合 miR-3068-5p，解除 miR-3068-5p 對靶基因 kB-Ras2 的轉(zhuǎn)錄后抑制，進(jìn)而調(diào)控下游 NF-κB 炎癥信號(hào)通路，最終改變巨噬細(xì)胞抗感染炎癥反應(yīng)強(qiáng)度；雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)直接證實(shí) Gm28309 與 miR-3068-5p 存在特異性直接結(jié)合關(guān)系（原文圖 5C、5D）。

3. miR-3068-5p/NF-κB 通路功能回補(bǔ)驗(yàn)證

抑制 miR-3068-5p 表達(dá)，或使用 NF-κB 通路特異性抑制劑 JSH-23 阻斷 p65 活化，均可明顯減弱 NLRP3 炎癥小體激活程度，提升胞內(nèi)布魯氏菌存活數(shù)量。該結(jié)果反向印證 Gm28309/miR-3068-5p/kB-Ras2/NF-κB 信號(hào)軸是調(diào)控布魯氏菌感染先天免疫的核心通路（原文圖 6）。

四、研究學(xué)術(shù)價(jià)值

本研究以 ZETA life Advanced DNA RNA 轉(zhuǎn)染試劑為核心實(shí)驗(yàn)工具，在 RAW264.7 小鼠巨噬細(xì)胞、PMA 誘導(dǎo)分化 THP-1 人巨噬細(xì)胞兩套模型中，完整完成 lncRNA-miRNA ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的功能與機(jī)制驗(yàn)證。研究揭示 lncRNA Gm28309 介導(dǎo)布魯氏菌免疫逃逸的分子通路，為胞內(nèi)菌感染性疾病的先天免疫調(diào)控研究提供全新分子靶點(diǎn)與標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞實(shí)驗(yàn)范式，相關(guān)成果已發(fā)表于國際免疫學(xué)期刊《Frontiers in Immunology》。