一、培養(yǎng)基與試劑選擇

優(yōu)先用專用上皮細(xì)胞培養(yǎng)基

不建議直接用普通 DMEM + 10% FBS，這類細(xì)胞對營養(yǎng)要求高，容易分化、長慢。

常用：

Keratinocyte-SFM（無血清）

EpiLife + 相應(yīng)添加劑

DMEM/F12 + 上皮細(xì)胞生長添加劑（含 EGF、胰島素、氫化可的松等）

慎用高血清

血清會促進(jìn)成纖維細(xì)胞污染生長，也會讓上皮細(xì)胞提前分化，一般血清≤5%，能無血清就無血清。

避免反復(fù)凍融添加劑

EGF、牛垂體提取物 BPE 等要分裝凍存，否則活性下降，細(xì)胞立刻長不好。

二、細(xì)胞接種與傳代

不要等細(xì)胞長太滿再傳代

融合度 70%~80% 就傳，超過 90% 容易分化、形態(tài)變差、甚至接觸抑制死亡。

胰酶消化要溫和

用 0.25% 胰酶 - EDTA 即可，不要用強(qiáng)消化液

消化時間30s~2min，鏡下看到細(xì)胞間隙變大、開始收縮就立刻終止

消化過度會導(dǎo)致：貼壁差、胞膜損傷、復(fù)蘇存活率暴跌。

傳代比例

一般 1:2 ~ 1:4，不要過度稀釋，這類細(xì)胞密度太低很難恢復(fù)。

接種密度不能太低

宮頸上皮細(xì)胞有明顯密度依賴，太稀會不增殖、慢慢飄死。

三、培養(yǎng)環(huán)境與耗材

必須使用明膠/多聚賴氨酸包被培養(yǎng)瓶

永生化宮頸上皮貼壁較弱，不包被容易大片飄起、成片死亡。

常用：0.1% 明膠 37℃包被 1h 或過夜。

CO? 嚴(yán)格 5%

培養(yǎng)基偏堿會迅速導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)變差。

不要頻繁挪動培養(yǎng)箱

溫度、pH 波動會讓上皮細(xì)胞應(yīng)激、皺縮、停止生長。

四、污染防控（非常關(guān)鍵）

嚴(yán)格 BSL-2 級別操作

這類細(xì)胞多由 HPV16 E6/E7 永生化，屬于重組生物，必須按生物安全二級操作。

嚴(yán)防支原體

支原體污染后，上皮細(xì)胞最典型表現(xiàn)：

生長變慢

邊緣粗糙、胞質(zhì)顆粒增多

轉(zhuǎn)染效率驟降

建議新細(xì)胞到后先做支原體檢測再擴(kuò)培。

避免交叉污染 HeLa 等強(qiáng)生長細(xì)胞

HeLa 長得極快，一旦混進(jìn)去幾天就把宮頸上皮“吃掉”。

建議分開操作臺、分開胰酶、分開培養(yǎng)基。

五、凍存與復(fù)蘇

凍存液配方

推薦：90% FBS + 10% DMSO

不要用無血清凍存液，上皮細(xì)胞耐受力差，存活率會很低。

程序降溫

直接放 - 80℃會大量死亡，要用凍存盒或梯度降溫。

復(fù)蘇快速融化

37℃水浴快速融化，離心去 DMSO，輕柔重懸，避免吹打過多。

復(fù)蘇前提前包被培養(yǎng)瓶

復(fù)蘇后貼壁差是見失敗原因。

六、形態(tài)與狀態(tài)判斷

正常狀態(tài)：

清晰多角形、鋪路石樣上皮形態(tài)

邊緣光滑，胞質(zhì)透亮

生長均勻，無梭形成纖維細(xì)胞

異常情況：

出現(xiàn)梭形細(xì)胞：成纖維污染或分化

細(xì)胞間隙大、不融合：營養(yǎng)不足或消化過度

大量漂浮：支原體、pH 異常、胰酶損傷

七、實(shí)驗(yàn)操作注意

不要過度饑餓處理

上皮細(xì)胞對無血清饑餓敏感，容易凋亡。

轉(zhuǎn)染效率偏低是正常現(xiàn)象

宮頸上皮本身不好轉(zhuǎn)染，推薦：

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染（優(yōu)化體系）

電轉(zhuǎn)

不要用對細(xì)胞毒性大的試劑。

盡量使用低代數(shù)細(xì)胞

永生化不等于不衰老，代數(shù)過高會形態(tài)改變、功能下降。

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