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人主動脈平滑肌細(xì)胞分離培養(yǎng)方法
人主動脈平滑肌細(xì)胞（HASMC）是主動脈中膜的核心組成細(xì)胞，存在收縮型與合成型兩種可相互轉(zhuǎn)化的表型，是血管重塑、動脈粥樣硬化等心血管疾病研究的重要體外細(xì)胞模型，其體外生長狀態(tài)與生物學(xué)特性直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性與重復(fù)性。
相較于永生化細(xì)胞系，原代 HASMC 保留了更接近體內(nèi)的生理功能，但該細(xì)胞同時具有貼壁依賴性強(qiáng)、增殖能力有限、表型易受環(huán)境調(diào)控、對培養(yǎng)條件高度敏感等特點(diǎn)。
準(zhǔn)確掌握其生長特性與狀態(tài)判定標(biāo)準(zhǔn)，是成功開展原代培養(yǎng)及后續(xù)實(shí)驗(yàn)的核心前提。
1、形態(tài)特征
原代 HASMC 為典型的貼壁依賴性細(xì)胞，其形態(tài)隨培養(yǎng)密度與生長狀態(tài)呈現(xiàn)規(guī)律性變化。
低密度生長狀態(tài)：接種后 24—48 小時完成貼壁，此時細(xì)胞呈單個散在分布，形態(tài)為規(guī)則長梭形或紡錘形，胞體透亮、折光性強(qiáng)，邊界清晰，細(xì)胞核呈卵圓形、居中分布，胞質(zhì)均勻無顆粒。
中密度生長狀態(tài)：進(jìn)入對數(shù)增殖期后，細(xì)胞開始向周圍延伸生長，逐漸形成短束狀排列，相鄰細(xì)胞沿同一方向平行生長。
高密度生長狀態(tài)：細(xì)胞融合增殖后，會形成平滑肌細(xì)胞擁有的 "峰谷狀" 排列模式，細(xì)胞密集區(qū)域呈多層束狀平行排列，形成 "峰"；細(xì)胞稀疏區(qū)域呈散在多角形分布，形成 "谷"。
該形態(tài)特征是區(qū)分 HASMC 與其他血管細(xì)胞的重要標(biāo)志 —— 成纖維細(xì)胞亦呈長梭形，呈漩渦狀或平行束狀排列，與平滑肌細(xì)胞形態(tài)相似，難以僅憑形態(tài)區(qū)分，需結(jié)合α-SMA免疫染色鑒別，也可通過形態(tài)學(xué)特征與血管內(nèi)皮細(xì)胞初步區(qū)分。
2、生長周期與增殖特性
原代 HASMC 的生長周期具有明顯的階段性，且受組織來源、分離方法及培養(yǎng)條件的影響較大。
1. 潛伏期：原代細(xì)胞貼壁緩慢，接種后存在 2—3 天的生長潛伏期，此階段細(xì)胞主要進(jìn)行貼壁、伸展及代謝適應(yīng)，增殖活動微弱。
潛伏期長短與組織活性密切相關(guān)，新鮮組織分離的細(xì)胞潛伏期較短，組織缺血時間過長則潛伏期延長甚至細(xì)胞死亡。
2. 對數(shù)增殖期：潛伏期結(jié)束后，細(xì)胞進(jìn)入快速增殖階段，即對數(shù)生長期。此階段細(xì)胞活力旺盛，形態(tài)規(guī)整，倍增時間約為 24—48 小時，是細(xì)胞傳代的好時期。
3、平臺期：當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到 80%—90% 時，由于細(xì)胞密度過高導(dǎo)致營養(yǎng)消耗、代謝產(chǎn)物積累及表型轉(zhuǎn)化，增殖速率減慢，逐漸進(jìn)入生長平臺期。此時細(xì)胞形態(tài)趨于一致，排列更加規(guī)整，但繼續(xù)培養(yǎng)會導(dǎo)致細(xì)胞肥大、代謝減慢，甚至出現(xiàn)表型轉(zhuǎn)化。
3、代次依賴性與表型穩(wěn)定性
HASMC 體外傳代能力有限，其表型與功能隨傳代次數(shù)增加會發(fā)生進(jìn)行性改變，即代次依賴性。
P1—P3 代：此代次細(xì)胞純度高、表型穩(wěn)定、功能活性佳，保留了體內(nèi)平滑肌細(xì)胞的收縮表型特征，能夠表達(dá) α- 平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、平滑肌肌球蛋白重鏈（SM-MHC）等特異性標(biāo)志物，是各類細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的首先選擇代次。
P4—P5 代：細(xì)胞增殖能力開始下降，形態(tài)逐漸變大、變扁，部分細(xì)胞失去典型梭形結(jié)構(gòu)，易出現(xiàn)表型異常轉(zhuǎn)化，收縮表型開始向合成表型轉(zhuǎn)化，特異性標(biāo)志物表達(dá)水平降低，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性有所下降，僅可用于部分非功能性實(shí)驗(yàn)。
P6 代及以上：細(xì)胞出現(xiàn)明顯的衰老特征，表現(xiàn)為增殖速率顯著減慢甚至停滯，細(xì)胞體積增大、形態(tài)鋪展變寬，wan全喪失收縮表型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可靠，不建議用于任何正式科學(xué)研究。
4、培養(yǎng)條件敏感性
HASMC 對體外培養(yǎng)環(huán)境與操作條件高度敏感，微小的環(huán)境變化即可導(dǎo)致細(xì)胞生長狀態(tài)異常。
1. 培養(yǎng)基依賴性：HASMC 對普通 DMEM、RPMI-1640 等基礎(chǔ)培養(yǎng)基適配性差，推薦使用平滑肌細(xì)胞專用wan全培養(yǎng)基，普通基礎(chǔ)培養(yǎng)基適配性較差。培養(yǎng)基成分的改變，如生長因子、血清濃度的變化，會直接影響細(xì)胞的增殖與表型。
2. 血清敏感性：標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)體系采用 10% 胎牛血清，血清是HASMC 生長所需營養(yǎng)物質(zhì)與生長因子的主要來源。
血清批次間的成分差異對細(xì)胞影響極為顯著，不同批次血清可能導(dǎo)致細(xì)胞增殖速率、形態(tài)及表型出現(xiàn)明顯波動，因此同一實(shí)驗(yàn)應(yīng)全程使用同一批號的胎牛血清。
3. 匯合度敏感性：細(xì)胞生長狀態(tài)對匯合度極為敏感。
傳代匯合度為 70%—80%，此時細(xì)胞處于對數(shù)增殖期，活力較強(qiáng)。
匯合度低于 60% 時傳代，細(xì)胞密度過低導(dǎo)致旁分泌信號不足，生長緩慢且分布不均；
當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到100%時，長期維持過密狀態(tài)會加速細(xì)胞老化和表型異常，導(dǎo)致傳代后增殖能力下降，因此應(yīng)避免在此狀態(tài)下放置過久。
4. 操作敏感性：胰酶消化時間、離心轉(zhuǎn)速與時間、吹打力度、無菌操作規(guī)范等操作細(xì)節(jié)均會直接影響細(xì)胞活性與純度。
胰酶消化過度會損傷細(xì)胞膜與細(xì)胞骨架，導(dǎo)致細(xì)胞貼壁困難、死亡；
吹打過于劇烈會產(chǎn)生大量氣泡，氣泡剪切力會破碎細(xì)胞，降低細(xì)胞存活率。
一、原代分離培養(yǎng)操作步驟
該細(xì)胞采用組織酶消化法分離人主動脈平滑肌細(xì)胞，操作簡便、細(xì)胞得率高、活性好，具體操作流程如下：
步驟1：取材與轉(zhuǎn)運(yùn)
將術(shù)后廢棄的主動脈組織置于組織保護(hù)液中，4℃條件下盡快轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室，全程低溫?zé)o菌轉(zhuǎn)運(yùn)、及時處理，全程無菌操作，杜絕細(xì)菌、真菌污染。
特別注意：取材到處理的時間越短越好！超過4小時細(xì)胞活力明顯下降，超過6小時原代培養(yǎng)成功率驟降。
全程低溫?zé)o菌操作，縮短組織離體時間，避免細(xì)胞缺氧壞死，缺血時間過長會導(dǎo)致組織自溶、細(xì)胞活力急劇下降，直接影響分離成功率。
步驟2：清洗與去膜
用含1% P/S的PBS反復(fù)清洗組織2-3遍，去除表面血跡和雜質(zhì)；
用彎頭鑷子輕輕刮除動脈的外膜層和內(nèi)膜層，保留中膜層——這是平滑肌細(xì)胞所在的位置。
操作要點(diǎn)：這一步是原代培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵！
去內(nèi)膜：內(nèi)膜含有內(nèi)皮細(xì)胞，不去除會導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞污染，影響純度。
去外膜：外膜富含成纖維細(xì)胞，成纖維細(xì)胞長得比平滑肌細(xì)胞快得多，一旦雜細(xì)胞污染，內(nèi)膜殘留會引入血管內(nèi)皮細(xì)胞，外膜殘留會混入成纖維細(xì)胞，必須che底刮除。
只保留中膜：中膜是平滑肌細(xì)胞所在的層，呈乳白色均勻質(zhì)地。
刮除時力度適中，既要che底清除外膜和內(nèi)膜又要避免損傷中膜層的平滑肌細(xì)胞；
如果組織塊小，寧可保留部分內(nèi)膜，也不要過度刮削導(dǎo)致中膜缺失。
步驟3：組織剪碎與清洗
將剝離干凈的血管中膜組織轉(zhuǎn)移至無菌培養(yǎng)皿中，用無菌眼科剪將組織剪成1 mm3左右的細(xì)小組織碎塊，然后加入無菌PBS充分吹打清洗，重復(fù)2–3次，直至清洗液清澈無血色、無雜質(zhì)殘留。
操作技巧：剪得越碎，后續(xù)消化效率越高，但不要剪成“泥狀”— 過度機(jī)械剪切會破壞細(xì)胞完整性。理想的碎塊狀態(tài)是“米粒大小、邊緣整齊”。
清洗至澄清是為了去除血細(xì)胞和破碎細(xì)胞釋放的蛋白酶，這些會影響消化效果。
步驟4：膠原酶消化
把清洗好的組織碎塊移入到離心管中，然后加入配制好的0.1% Ⅰ型膠原酶，wan全浸沒組織塊，將離心管置于37℃電熱恒溫震蕩水槽中，恒溫震蕩消化30–40 min，震蕩速度輕柔均勻，保證酶液與組織充分接觸，避免局部消化不足或過度消化。
關(guān)鍵提醒：Ⅰ型膠原酶消化時間需嚴(yán)格把控，不足30 min會導(dǎo)致細(xì)胞解離不wan全、得率極低；超過40 min易造成細(xì)胞膜損傷、細(xì)胞活性大幅下降。
須用37℃震蕩水浴，震蕩水浴需溫度恒定，避免溫差影響消化效果，震蕩能提高消化效率和均勻度。
消化完畢后組織塊應(yīng)變得松散、邊緣毛糙，但不應(yīng)wan全消失。
步驟5：吹打與過濾
消化結(jié)束后，取出樣品，用無菌移液管反復(fù)輕柔吹打組織懸液數(shù)十次，充分解離組織中的單個細(xì)胞。
隨后將懸液通過100 μm無菌濾網(wǎng)過濾，去除未消化的大塊組織和碎片，收集純凈的細(xì)胞濾液。
關(guān)鍵提醒：吹打時力度適中，力度均勻，不要產(chǎn)生氣泡，氣泡破裂的剪切力會損傷細(xì)胞膜。
步驟6：離心重懸鋪瓶
將收集的細(xì)胞濾液置于高速離心機(jī)中，300 g離心10 min，離心結(jié)束后小心棄去上清液，避免觸碰管底細(xì)胞沉淀。
加入適量平滑肌細(xì)胞專用wan全培養(yǎng)基，輕柔吹打重懸細(xì)胞沉淀，制備均勻的細(xì)胞懸液，接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。
關(guān)鍵提醒：離心速度300g是折中選擇——太快損傷原代細(xì)胞，太慢細(xì)胞回收率低。
重懸時動作輕柔，吹打3-5次至均勻即可，不要反復(fù)強(qiáng)力吹打。
一個T25瓶接種一個主動脈樣本的細(xì)胞量通常足夠，密度過低不利于原代細(xì)胞生長。
步驟7：換液與觀察
將培養(yǎng)瓶置于37℃、5% CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。
每日通過熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞貼壁、形態(tài)、生長狀態(tài)及污染情況，隔天更換新的wan全培養(yǎng)基，去除未貼壁的細(xì)胞與組織碎片，待細(xì)胞融合密度達(dá)到80%左右時，即可進(jìn)行細(xì)胞傳代操作。
關(guān)鍵提醒：頭一次換液不要太早！原代細(xì)胞貼壁需要時間，過早換液會移除細(xì)胞分泌的自分泌因子，這些因子對原代細(xì)胞貼壁和存活有保護(hù)作用。
換液時保留1/3舊液，補(bǔ)充2/3新液，過渡2-3次后再全換液。
二、細(xì)胞傳代培養(yǎng)操作
當(dāng)原代細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時，細(xì)胞增殖狀態(tài)良好，適合傳代，具體操作如下：
1、預(yù)處理
提前將wan全培養(yǎng)基、PBS、0.25%胰蛋白酶（含EDTA）拿出來，避免低溫刺激細(xì)胞，提前開啟生物安全柜紫外消毒30 min，保證無菌環(huán)境。
2、清洗棄殘液
取出培養(yǎng)瓶，棄去舊培養(yǎng)基，用無菌PBS輕柔清洗細(xì)胞貼壁面1次，che底去除殘留血清，避免血清抑制胰酶消化活性。
3、消化脫落
向T25培養(yǎng)瓶中加入適量0.25%（含0.02%）胰蛋白酶，輕輕晃動培養(yǎng)瓶使酶液均勻覆蓋細(xì)胞層，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1–2 min，顯微鏡下觀察，待細(xì)胞皺縮、變圓、少量脫落時，立即加入等量wan全培養(yǎng)基終止消化。
4、離心接種
輕柔吹打瓶壁細(xì)胞，使細(xì)胞wan全脫落，收集細(xì)胞懸液于無菌離心管中，1000rpm離心5 min —棄上清—加入wan全培養(yǎng)基—重懸細(xì)胞，按1:2 比例分瓶接種，置于37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
特別注意事項(xiàng)：
1、專用培養(yǎng)基培養(yǎng)
HA-VSMC不可使用普通DMEM培養(yǎng)基，推薦使用平滑肌細(xì)胞專用wan全培養(yǎng)基，可有效維持細(xì)胞收縮型表型，防止細(xì)胞異常增殖、表型轉(zhuǎn)化。
2、嚴(yán)控消化程度
該細(xì)胞貼壁牢固但對胰酶敏感，消化時間不可過長，消化過度會導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷、貼壁延遲。
終止消化必須及時，吹打動作輕柔，避免機(jī)械損傷細(xì)胞，降低細(xì)胞死亡率。
3、合理把控傳代密度
細(xì)胞不可高密度長滿培養(yǎng)，匯合度超過90%易導(dǎo)致細(xì)胞老化、形態(tài)異常、表型轉(zhuǎn)化，80%融合度為合理傳代節(jié)點(diǎn)。
4、傳代比例不宜過大
人主動脈平滑肌細(xì)胞增殖能力有限，傳代比例初次建議1:2，不建議1:3或1:4以上會導(dǎo)致細(xì)胞老化加速，代次越高越明顯。
5、限定實(shí)驗(yàn)代次
優(yōu)先選用P1–P3代細(xì)胞開展實(shí)驗(yàn)，P6及以上細(xì)胞會出現(xiàn)增殖緩慢、梭形形態(tài)消失、細(xì)胞扁平肥大等老化現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)誤差較大。
三、原代細(xì)胞凍存
一般原代細(xì)胞不建議凍存，原代細(xì)胞增殖次數(shù)有限，凍存后再復(fù)蘇培養(yǎng)細(xì)胞狀態(tài)會變差，活性會降低，如果一定要凍存，建議在低代次（如 P1—P3 代）、細(xì)胞生長狀態(tài)優(yōu)良時及早凍存。
細(xì)胞經(jīng)凍存液重懸后裝入凍存管，放入程序降溫盒 → -80℃過夜 → 第二天轉(zhuǎn)入液氮長期保存。
注：
復(fù)蘇后細(xì)胞狀態(tài)可能較凍存前略有下降（如貼壁率稍低、增殖延遲），但通過規(guī)范化凍存操作也可保留細(xì)胞活性。
四、生長狀態(tài)與特性觀察
1、階段形態(tài)特征
培養(yǎng)階段 | 形態(tài)特征 |
接種后4-8h | 細(xì)胞開始貼壁，呈圓形或短梭形 |
接種后24h | 多數(shù)細(xì)胞已貼壁伸展，呈長梭形 |
低密度時 | 細(xì)胞分散，網(wǎng)狀或放射狀排列 |
中等密度 | 細(xì)胞開始平行排列，出現(xiàn)方向性 |
匯合狀態(tài) | 典型"峰與谷"（hills and valleys）旋渦狀排列——這是平滑肌細(xì)胞的標(biāo)志性形態(tài)！ |
2、生長曲線特點(diǎn)
潛伏期 | 原代接種后1-3天（細(xì)胞適應(yīng)新環(huán)境，增殖緩慢） |
對數(shù)生長期 | 第3-7天（快速增殖，倍增時間約36-48小時） |
平臺期 | 匯合度>80%后增殖減緩 |
3、表型漂移監(jiān)控
這是HASMC培養(yǎng)中最需要警惕的問題。以下信號提示表型正在漂移：
正常收縮型 | 異常合成型（表型漂移） |
典型長梭形 | 變寬變短，形態(tài)趨于"上皮樣" |
峰與谷"排列 | 排列雜亂，失去方向性 |
增殖較慢 | 增殖突然加速 |
α-SMA強(qiáng)陽性 | α-SMA表達(dá)減弱 |
建議：
關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)使用P3-P5代細(xì)胞，不超過P6；
每次實(shí)驗(yàn)前做α-SMA免疫熒光鑒定，確認(rèn)純度>90%；
使用iCell配套的平滑肌細(xì)胞專用培養(yǎng)基，有助于維持收縮表型。
五、細(xì)胞生長狀態(tài)判斷
準(zhǔn)確區(qū)分細(xì)胞的正常與異常生長狀態(tài)，是及時發(fā)現(xiàn)問題、保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行的關(guān)鍵。
1、正常狀態(tài)判定
細(xì)胞貼壁牢固，形態(tài)規(guī)整統(tǒng)一，呈典型長梭形，胞質(zhì)均勻透亮，無空泡、顆粒及雜質(zhì)堆積；
細(xì)胞排列有序，形成明顯的 "峰谷狀" 結(jié)構(gòu)；
增殖速率穩(wěn)定，對數(shù)生長期倍增時間為 24—48 小時；
培養(yǎng)基清亮，顏色隨培養(yǎng)時間逐漸變黃，無渾濁、無異味；
換液時僅有極少量懸浮死細(xì)胞。
2、異常狀態(tài)預(yù)警
細(xì)胞貼壁率低、大量懸浮死亡：提示組織缺血時間過長、消化過度、吹打劇烈或試劑未預(yù)熱。
細(xì)胞形態(tài)異常：細(xì)胞變圓、皺縮、邊界模糊，或出現(xiàn)大量多邊形、不規(guī)則異形細(xì)胞，提示細(xì)胞損傷、污染或表型漂移。
胞質(zhì)空泡化、色素顆粒增多：提示細(xì)胞衰老，若為空泡為主、無典型色素顆粒，則提示營養(yǎng)缺乏或代謝廢物堆積。
增殖緩慢或停滯：提示傳代密度過低（<60%）或過高（100%維持過久）、血清活性差、培養(yǎng)基成分不合適或細(xì)胞代次過高。
培養(yǎng)基快速渾濁、變黃、有異味：提示細(xì)菌或真菌污染，應(yīng)立即丟棄細(xì)胞，防止交叉污染。
雜細(xì)胞生長：出現(xiàn)鋪路石樣內(nèi)皮細(xì)胞或長梭形、漩渦狀排列的成纖維細(xì)胞，提示血管內(nèi)膜或外膜剝離不che底，細(xì)胞純度不足。
六、實(shí)驗(yàn)避坑指南
坑點(diǎn)1： 成纖維細(xì)胞污染
表現(xiàn)：培養(yǎng)瓶中出現(xiàn)形態(tài)更扁平、鋪展更寬、生長更快的細(xì)胞，逐漸"吃掉"平滑肌細(xì)胞的生存空間。
原因：內(nèi)膜外膜剝離不che底、PBS清洗不充分，成纖維細(xì)胞混入。
解決：重點(diǎn)剝離血管中膜，多次清洗組織碎塊。
如果已經(jīng)出現(xiàn)雜細(xì)胞污染，可用差速貼壁法：成纖維細(xì)胞貼壁更快，短暫培養(yǎng)后先貼壁的丟棄。
坑點(diǎn)2：內(nèi)皮細(xì)胞污染
表現(xiàn)：出現(xiàn)典型的"鵝卵石"樣排列的細(xì)胞。
原因：內(nèi)膜刮除不干凈。
解決：內(nèi)膜必須che底刮除；可用CD31免疫染色確認(rèn)有無內(nèi)皮細(xì)胞殘留。
坑點(diǎn)3：細(xì)胞形態(tài)異常、生長緩慢
原因：培養(yǎng)基不匹配、傳代過晚、接種密度太低、血清批次不合格。
解決：固定使用專用平滑肌細(xì)胞wan全培養(yǎng)基；嚴(yán)格80%密度傳代；選用合格批次胎牛血清。
坑點(diǎn)4：細(xì)胞增殖緩慢、細(xì)胞聚團(tuán)
原因：消化不充分、換液不及時、吹打不充分、傳代密度過低或過高、培養(yǎng)箱CO?濃度或溫度不穩(wěn)定。
解決：控制好消化時間，保證細(xì)胞均勻脫落；及時換液；查看培養(yǎng)箱溫度與CO?濃度，維持穩(wěn)定培養(yǎng)環(huán)境。
坑點(diǎn)5：支原體、細(xì)菌污染
支原體污染：細(xì)胞生長緩慢、形態(tài)異常、培養(yǎng)基顏色變黃（但澄清），傳代后細(xì)胞狀態(tài)持續(xù)變差。
細(xì)菌/真菌污染：培養(yǎng)基快速變黃、渾濁、有異味，可見菌絲或游動顆粒。
原因：超凈臺、培養(yǎng)箱、水浴鍋消殺不che底，培養(yǎng)箱內(nèi)交叉污染，操作環(huán)境無菌不達(dá)標(biāo)，隱性細(xì)菌、真菌污染，試劑污染。
解決：定期做支原體PCR檢測，全程無菌操作，出現(xiàn)污染情況立即丟棄細(xì)胞避免污染其他細(xì)胞，杜絕細(xì)菌、真菌污染。
使用iCell支原體陰性的細(xì)胞產(chǎn)品，從源頭杜絕細(xì)胞污染。
人主動脈平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)的核心關(guān)鍵為精準(zhǔn)剝離組織、可控酶消化、溫和機(jī)械操作、穩(wěn)定培養(yǎng)環(huán)境、嚴(yán)控傳代代次與時機(jī)。
該細(xì)胞體外培養(yǎng)敏感性高、表型易變，相較于普通細(xì)胞系，更依賴標(biāo)準(zhǔn)化、精細(xì)化的實(shí)操流程。
規(guī)避各類實(shí)操誤區(qū)，可穩(wěn)定獲得活性高、純度高、表型正常的HASMC，為后續(xù)血管重塑、心血管疾病機(jī)制、藥物篩選等實(shí)驗(yàn)提供可靠的細(xì)胞模型。
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