在免疫學(xué)研究中，以體液免疫和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答綜合分析為基礎(chǔ)，對(duì)感染性疾病、自免疾病病、疫苗效力等進(jìn)行深入研究。如何準(zhǔn)確檢測(cè)體液中游離的細(xì)胞因子或抗體，對(duì)免疫應(yīng)答做出全面評(píng)估，是選擇實(shí)驗(yàn)方法的重要指標(biāo)。

ELISpot（即酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)）在ELISA基礎(chǔ)上，結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，衍生出的高靈敏度免疫檢測(cè)方法。它能夠在單細(xì)胞水平檢測(cè)分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞頻率。分泌靶點(diǎn)因子的陽(yáng)性細(xì)胞會(huì)在膜上形成可計(jì)數(shù)的斑點(diǎn)，反映出有多少個(gè)細(xì)胞參與了免疫應(yīng)答。

ELISpot操作簡(jiǎn)單，基本與ELISA類似。通過(guò)常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)獲得低滲裂解細(xì)胞后，進(jìn)行抗體孵育和Streptavidin-ALP酶標(biāo)記，完成顯色反應(yīng)后讀數(shù)。ELISpot的難點(diǎn)可能在讀數(shù)，需要專業(yè)的判讀標(biāo)準(zhǔn)和設(shè)備儀器。

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01 ELISpot：從細(xì)胞分泌到斑點(diǎn)計(jì)數(shù)

ELISpot巧妙地將細(xì)胞培養(yǎng)、抗體捕獲及酶促顯色結(jié)合在一起，具有單細(xì)胞水平的分辨率。它將某個(gè)細(xì)胞是否被激活、是否正在分泌靶蛋白轉(zhuǎn)化為直觀的“斑點(diǎn)形成單位（SFU）”數(shù)值，能夠檢測(cè)低頻免疫應(yīng)答。在檢測(cè)抗原特異性T細(xì)胞、疫苗誘導(dǎo)的Th1型應(yīng)答或腫瘤相關(guān)抗原刺激后的T細(xì)胞功能篩查時(shí)，ELISpot比僅測(cè)定上清濃度的ELISA更接近細(xì)胞活性頻率。

那么，我們?cè)谶M(jìn)行研究時(shí)如何選擇合適的檢測(cè)方法呢？

· ELISA：如果需要檢測(cè)細(xì)胞因子總體分泌水平，建議使用ELISA。

· ELISpot：如果是要了解這群細(xì)胞中有多少細(xì)胞因抗原刺激而造成分泌水平變化，或?qū)Φ皖l抗原特異性細(xì)胞應(yīng)答進(jìn)行篩查，建議優(yōu)先考慮ELISpot。

· FCM：如果是要知道應(yīng)答細(xì)胞來(lái)自哪類亞群及標(biāo)志物等多參數(shù)信息時(shí)，需要選擇流式細(xì)胞術(shù)（FCM）

· TR-FRET：如果是大樣本、多批次的高通量檢測(cè)需求，建議試一試TR-FRET（時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)）。義翹神州TR-FRET試劑盒上市，推出0元試用活動(dòng)，點(diǎn)擊免費(fèi)申請(qǐng)100 Tests試劑盒。

實(shí)驗(yàn)的需求是多種多樣的，我們的實(shí)驗(yàn)選擇也是多樣的。在項(xiàng)目開(kāi)發(fā)過(guò)程中，我們要根據(jù)實(shí)際需求進(jìn)行選擇和結(jié)合，ELISpot與ELISA、FCM、TR-FRET等實(shí)驗(yàn)技術(shù)形成互補(bǔ)，而不是替代。

02 ELISpot在研發(fā)中的應(yīng)用案例

01在疫苗研發(fā)中的應(yīng)用

目前，已有多項(xiàng)指導(dǎo)原則推薦使用ELISpot檢測(cè)細(xì)胞的免疫反應(yīng)。例如，CDE發(fā)布《新型-冠狀病毒預(yù)防用mRNA疫苗藥學(xué)研究》，中國(guó)食品藥品檢定研究院發(fā)布《預(yù)防用DNA疫苗臨床前研究技術(shù)指導(dǎo)原則》及《預(yù)防用以病毒為載體的活疫苗制劑的技術(shù)指導(dǎo)原則》。國(guó)際艾滋病疫苗行動(dòng)計(jì)劃中監(jiān)測(cè)新型HIV疫苗的試驗(yàn)推薦使用ELISpot技術(shù)。

IFN-γ是疫苗研發(fā)中常用ELISpot檢測(cè)的一個(gè)指標(biāo)。機(jī)體在接種疫苗后，IFN-γ的表達(dá)水平直接反映輔助性T細(xì)胞的活化狀態(tài)。ELISpot通過(guò)測(cè)量T細(xì)胞反應(yīng)能力來(lái)定義疫苗效果。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞分泌IL-2、TNF-α、IL-4、IL-5等痕量細(xì)胞因子的表達(dá)水平，可進(jìn)一步分析免疫反應(yīng)偏向性，深入理解疫苗引起的免疫應(yīng)答機(jī)制。

02在細(xì)胞免疫治療開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用

ELISpot技術(shù)可用于CAR-T產(chǎn)品開(kāi)發(fā)階段檢測(cè)T細(xì)胞免疫應(yīng)答功能的測(cè)試，比如IFN-γ、IL-2、TNF-α等細(xì)胞因子分泌水平評(píng)估。Hu等人在開(kāi)發(fā)靶向CD19的CAR-T療法過(guò)程中，利用IFN-γ ELISpot分析11名患者外周血免疫反應(yīng)情況，結(jié)果顯示雙敲除DKO和低免疫原性HIP的CAR-T細(xì)胞未激活T細(xì)胞，而野生型WT細(xì)胞強(qiáng)烈激活T細(xì)胞，并在第28天達(dá)到峰值。證實(shí)HIP CAR-T細(xì)胞不會(huì)引發(fā)免疫反應(yīng)，有效逃避免疫系統(tǒng)的排斥反應(yīng)。

 ELISpot檢測(cè)患者外周血的結(jié)果

（源自文獻(xiàn)：doi: 10.1016/j.stem.2025.07.009）

03在其他領(lǐng)域的更多應(yīng)用

Kathryn團(tuán)隊(duì)通過(guò)優(yōu)化的IFN-γ ELISpot方法，監(jiān)測(cè)腺病毒（AAV）基因療法的細(xì)胞免疫反應(yīng)情況。在一項(xiàng)AAV5-FVIII基因治療臨床試驗(yàn)中，給藥2周后，可在大多數(shù)受試者中檢測(cè)到靶向AAV5衣殼蛋白的免疫反應(yīng)。

Oxford Immunotec公司基于ELISpot原理開(kāi)發(fā)的T-SPOT.TB結(jié)核病診斷試劑盒已獲FDA批準(zhǔn)，用以定量檢測(cè)患者血液或體液樣品中結(jié)核效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)，判斷患者結(jié)核分枝桿菌感染狀態(tài)。它可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的皮膚測(cè)試，并且不受卡介苗接種的影響。

ELISpot技術(shù)也可用于自身免疫性疾病的診斷和機(jī)制研究中，如I型糖尿病、多發(fā)性硬化、重癥肌無(wú)力、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等，分析異常的免疫細(xì)胞激活和細(xì)胞因子分泌譜。

義翹神州ELISpot試劑盒

ELISpot實(shí)驗(yàn)體系需要標(biāo)準(zhǔn)化。細(xì)胞活率、抗原刺激條件、陰性與陽(yáng)性對(duì)照、洗板強(qiáng)度、顯色時(shí)間、讀板參數(shù)、背景扣除方式等都有可能影響讀板結(jié)果（SFU值）。

義翹神州ELISpot檢測(cè)試劑盒正是圍繞這一痛點(diǎn)設(shè)計(jì)。其預(yù)包被ELISpot檢測(cè)試劑盒經(jīng)PVDF板包被、無(wú)菌干燥、真空密封包裝等流程制備，可檢測(cè)IFN-γ、IL-2、IL-4等多種關(guān)鍵細(xì)胞因子。試劑盒即用型預(yù)包被，具有重復(fù)性高、檢測(cè)流程簡(jiǎn)單、超高靈敏度等特點(diǎn)，是檢測(cè)人源或鼠源細(xì)胞因子優(yōu)先考慮的標(biāo)準(zhǔn)化方案。

增值服務(wù)

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【參考文獻(xiàn)】

1. Hu X, et al. Hypoimmune CD19 CAR T cells evade allorejection in patients with cancer and autoimmune disease. Cell Stem Cell. 2025. doi: 10.1016/j.stem.2025.07.009

2. Patton KS, et al. Monitoring cell-mediated immune responses in AAV gene therapy clinical trials using a validated IFN-γ ELISpot method. Mol Ther Methods Clin Dev. 2021 doi: 10.1016/j.omtm.2021.05.012

3. Lu J, et al. Effectiveness of a broad-spectrum bivalent mRNA vaccine against SARS-CoV-2 variants in preclinical studies. Emerg Microbes Infect. 2024. doi: 10.1080/22221751.2024.2321994

4. Folegatti PM, etal. Oxford COVID Vaccine Trial Group. Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial. Lancet. 2020. doi: 10.1016/S0140-6736(20)31604-4.