百歐博偉生物：無菌操作是檢驗(yàn)工作（涵蓋微生物檢驗(yàn)、細(xì)胞檢驗(yàn)、生物樣本檢測(cè)等）的核心基礎(chǔ)，其核心目標(biāo)是防止環(huán)境中雜菌/污染物侵入樣本、培養(yǎng)基或?qū)嶒?yàn)體系，同時(shí)避免樣本中目標(biāo)微生物/細(xì)胞交叉污染，確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和重復(fù)性。以下從“核心原則、標(biāo)準(zhǔn)操作流程、各場(chǎng)景專項(xiàng)要求、質(zhì)量控制與常見問題解決”四個(gè)維度，系統(tǒng)梳理無菌操作的全流程要求，兼顧規(guī)范性與實(shí)操性。

一、無菌操作的核心原則

隔離污染源：將實(shí)驗(yàn)體系（樣本、培養(yǎng)基、試劑、實(shí)驗(yàn)器材）與環(huán)境中的微生物（空氣、桌面、操作人員體表）物理隔離；

全程無菌化：實(shí)驗(yàn)前對(duì)器材、試劑、環(huán)境滅菌，實(shí)驗(yàn)中維持無菌狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)后規(guī)范處理廢棄物，形成“前 - 中 - 后”閉環(huán)；

避免交叉污染：不同樣本、不同批次實(shí)驗(yàn)分開操作，專用器材不混用，操作人員手部/衣物不直接接觸無菌面；

最小暴露原則：無菌物品/體系的暴露時(shí)間、暴露面積最小化，減少污染概率。

二、無菌操作的標(biāo)準(zhǔn)流程（通用要求）

（一）實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：滅菌與環(huán)境優(yōu)化

1、實(shí)驗(yàn)環(huán)境滅菌

核心區(qū)域：生物安全柜（BSC）、超凈工作臺(tái)是無菌操作的場(chǎng)所，使用前需開啟紫外燈照射 30 分鐘（注意：紫外燈僅殺滅表面微生物，無法穿透玻璃/塑料，且對(duì)人體有害，照射時(shí)需關(guān)閉柜門、人員撤離）；照射后通風(fēng) 15-20 分鐘，避免紫外殘留。

輔助區(qū)域：實(shí)驗(yàn)臺(tái)面用 75% 乙醇擦拭（從內(nèi)向外單向擦拭，避免來回交叉），地面、墻壁定期用含氯消毒劑噴灑消毒（每周 1-2 次）；

環(huán)境要求：無菌室/實(shí)驗(yàn)室需保持密閉、干燥，溫度控制在 20-25℃，濕度 40%-60%；定期監(jiān)測(cè)空氣潔凈度（微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室需達(dá)到萬級(jí)潔凈度，局部百級(jí)，即生物安全柜內(nèi)）。

2、實(shí)驗(yàn)器材滅菌

器材類型           滅菌方式        操作要求與注意事項(xiàng)

玻璃器皿（試管、培養(yǎng)皿、移液管） 干熱滅菌（160℃，2-3 小時(shí)）或高壓蒸汽滅菌（121℃，1.05kg/cm2，20 分鐘） 干熱滅菌前需洗凈烘干（無水分殘留，避免滅菌時(shí)炸裂）；高壓蒸汽滅菌需確保器材浸沒在蒸汽中，排氣（排除冷空氣，否則溫度達(dá)不到設(shè)定值）

塑料器材（離心管、吸頭、培養(yǎng)瓶） 輻照滅菌（一次性器材）或高壓蒸汽滅菌（可重復(fù)使用塑料） 一次性無菌器材需檢查包裝完整性（無破損、無漏液），有效期內(nèi)使用；重復(fù)使用塑料器材滅菌后需密封保存，避免二次污染

培養(yǎng)基、緩沖液、試劑 高壓蒸汽滅菌（含糖類/熱敏成分用 115℃，15 分鐘；不含熱敏成分用 121℃，20 分鐘）或過濾滅菌（0.22μm 濾膜） 高壓滅菌后需快速冷卻（避免營(yíng)養(yǎng)成分降解），過濾滅菌需使用無菌濾器，操作時(shí)濾器出口避免接觸非無菌表面

金屬器材（接種環(huán)、鑷子、剪刀） 灼燒滅菌（酒精燈外焰，燒至紅熱）或干熱滅菌 接種環(huán)每次使用前后均需灼燒，冷卻后再接觸樣本（避免高溫殺死目標(biāo)微生物/細(xì)胞）；金屬器材滅菌后需放在無菌容器中保存

3、操作人員準(zhǔn)備

著裝：穿戴無菌工作服（或隔離衣）、無菌手套、口罩、帽子，頭發(fā)、胡須需遮蓋（避免毛發(fā)脫落污染）；禁止佩戴首飾（戒指、手鐲等易殘留微生物）、穿拖鞋進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室；

手部消毒：先用肥皂/洗手液流動(dòng)水洗手（七步洗手法：掌心→手背→指縫→指背→拇指→指尖→手腕），擦干后用 75% 乙醇擦拭雙手（包括手腕以上 10cm），待乙醇揮發(fā)后戴無菌手套（手套需無破損，佩戴時(shí)避免接觸非無菌面，如桌面、衣物）；

狀態(tài)要求：操作人員需保持健康狀態(tài)，感冒、腹瀉或皮膚有傷口時(shí)避免參與無菌操作（傷口需用無菌紗布覆蓋，必要時(shí)戴雙層手套）；禁止在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飲食、飲水、交談（避免飛沫污染）。

（二）實(shí)驗(yàn)中操作：規(guī)范執(zhí)行與風(fēng)險(xiǎn)控制

1、無菌物品取用與處理

原則：所有無菌物品（培養(yǎng)基、吸頭、試管等）需在生物安全柜/超凈工作臺(tái)內(nèi)打開包裝，包裝開口朝向無菌區(qū)域，避免開口接觸非無菌面（如臺(tái)面、操作人員手套外側(cè)）；

取用工具：使用無菌移液管、移液器、鑷子等取用無菌物品，移液管鑷子避免接觸任何非無菌表面；移液器需定期校準(zhǔn)，吸頭與移液器桿緊密貼合（避免漏氣導(dǎo)致污染）；

培養(yǎng)基處理：熔化后的固體培養(yǎng)基需冷卻至 50-60℃（手感不燙手）時(shí)倒平板，倒平板時(shí)瓶口靠近酒精燈火焰（形成無菌區(qū)），每個(gè)培養(yǎng)皿倒 15-20ml，避免培養(yǎng)基濺出；倒好后靜置冷卻至凝固（約 30 分鐘），倒置存放（防止冷凝水滴落污染菌落）。

2、樣本接種與處理（核心操作）

火焰無菌技術(shù)：接種環(huán)、接種針使用前在酒精燈外焰燒至紅熱（全程在火焰上方 5-10cm 處操作，形成無菌氣流區(qū)），冷卻 30 秒（可接觸無菌培養(yǎng)基邊緣測(cè)試，無滋滋聲即可）后再接觸樣本；操作過程中，試管口、培養(yǎng)瓶口需通過火焰快速灼燒（旋轉(zhuǎn) 2-3 圈，殺滅瓶口微生物），開蓋后瓶口朝上傾斜 45°（避免灰塵落入），操作完畢后立即蓋蓋并再次灼燒瓶口；

移液操作：移液時(shí)移液器垂直操作，吸頭不接觸容器內(nèi)壁、液面以下（避免交叉污染）；不同樣本使用不同吸頭，同一樣本不同稀釋度按從低濃度到高濃度順序操作；

樣本防護(hù)：處理含病原微生物的樣本（如臨床標(biāo)本、致病性菌株）時(shí)，需在二級(jí)及以上生物安全柜內(nèi)操作，操作人員需穿防護(hù)服、戴護(hù)目鏡（防止樣本飛濺感染）；

避免過度暴露：無菌體系（如培養(yǎng)皿開蓋后、試管開蓋后）暴露時(shí)間不超過 1 分鐘，操作過程緊湊有序，減少不必要的動(dòng)作（如頻繁開關(guān)柜門、走動(dòng)）。

3、實(shí)驗(yàn)器材擺放與管理

生物安全柜/超凈工作臺(tái)內(nèi)器材按“功能分區(qū)”擺放：左側(cè)為無菌物品區(qū)（培養(yǎng)基、吸頭、試管），中間為操作區(qū)（樣本處理、接種），右側(cè)為廢棄物區(qū)（污染吸頭、廢液缸），避免交叉污染；

非無菌物品（如手機(jī)、筆記本、試劑包裝盒）禁止放入操作區(qū)；

實(shí)驗(yàn)過程中，手套若接觸非無菌面（如桌面、門把手），需立即更換手套或用 75% 乙醇擦拭手套消毒。

（三）實(shí)驗(yàn)后處理：污染控制與廢棄物處置

實(shí)驗(yàn)器材清潔與滅菌：

污染器材（如接種環(huán)、培養(yǎng)皿、離心管）需先浸泡在含氯消毒劑中 30 分鐘（殺滅病原微生物），再清洗、烘干、滅菌；

重復(fù)使用的玻璃器皿需用洗滌劑浸泡超聲清洗（去除殘留樣本/培養(yǎng)基），洗凈后烘干再滅菌；

廢棄物處理：

生物廢棄物（如污染的吸頭、樣本殘?jiān)?、培養(yǎng)基）需放入黃色醫(yī)療垃圾袋，密封后高壓蒸汽滅菌（121℃，20 分鐘），再按醫(yī)療廢物處理規(guī)定轉(zhuǎn)運(yùn)；

化學(xué)廢棄物需分類收集，交由專業(yè)機(jī)構(gòu)處理，禁止直接排放；

環(huán)境終末消毒：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用 75% 乙醇擦拭生物安全柜/超凈工作臺(tái)臺(tái)面、移液器、鑷子等器材，開啟紫外燈照射 30 分鐘；實(shí)驗(yàn)室內(nèi)通風(fēng)換氣，記錄消毒時(shí)間、操作人員、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（便于追溯）。

三、各檢驗(yàn)場(chǎng)景的專項(xiàng)無菌操作要求

不同檢驗(yàn)場(chǎng)景的無菌操作重點(diǎn)不同，以下針對(duì)核心場(chǎng)景給出具體要求：

（一）微生物檢驗(yàn)（細(xì)菌、真菌、病毒分離與鑒定）

樣本處理：臨床樣本需在生物安全柜內(nèi)開啟，避免樣本飛濺；處理糞便樣本時(shí)，需戴雙層手套，操作后立即更換手套并消毒；

培養(yǎng)基接種：

平板劃線法：接種環(huán)每次劃線后需灼燒滅菌，冷卻后再劃線（避免殺死目標(biāo)菌）；劃線時(shí)從邊緣向中心劃，線條清晰，避免重疊；

傾注平板法：樣本稀釋液與熔化冷卻的培養(yǎng)基混合時(shí)，瓶口需通過火焰滅菌，混合后快速搖勻（避免氣泡產(chǎn)生），靜置凝固后倒置培養(yǎng)；

菌落挑?。禾羧尉浜?，接種環(huán)需立即灼燒滅菌；不同菌落需使用不同接種環(huán)，避免交叉污染；

病毒培養(yǎng)：需在三級(jí)生物安全柜內(nèi)操作（針對(duì)高致病性病毒），細(xì)胞培養(yǎng)瓶開蓋后需在火焰旁操作，避免病毒氣溶膠擴(kuò)散。

（二）細(xì)胞培養(yǎng)（貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞）

試劑準(zhǔn)備：培養(yǎng)基、血清、胰酶等試劑需在 4℃冰箱冷藏保存，使用前恢復(fù)至室溫（避免溫度驟變導(dǎo)致細(xì)胞損傷）；血清需過濾滅菌（0.22μm 濾膜），避免支原體污染；

細(xì)胞復(fù)蘇與傳代：

復(fù)蘇：凍存管從液氮罐取出后，立即放入 37℃水浴鍋快速解凍（1-2 分鐘內(nèi)融化），解凍后在生物安全柜內(nèi)打開，用無菌移液管轉(zhuǎn)移至含培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，輕輕搖勻（避免劇烈震蕩）；

傳代：貼壁細(xì)胞用胰酶消化時(shí)，胰酶需預(yù)熱至 37℃，消化時(shí)間控制在 1-3 分鐘（根據(jù)細(xì)胞類型調(diào)整），消化后立即加入含血清的培養(yǎng)基終止消化；離心后棄上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種至新培養(yǎng)瓶；

污染防控：

定期檢測(cè)培養(yǎng)基是否污染（觀察是否有渾濁、顏色變化、絮狀物）；

細(xì)胞培養(yǎng)過程中，若發(fā)現(xiàn)污染（如細(xì)菌污染導(dǎo)致培養(yǎng)基渾濁、真菌污染出現(xiàn)白色菌絲），需立即終止培養(yǎng)，污染樣本高壓滅菌后處理，避免擴(kuò)散；

支原體檢測(cè)：每 1-2 周對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行支原體檢測(cè)（常用 PCR 法或熒光染色法），支原體污染后無明顯外觀變化，但會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，需嚴(yán)格防控。

（三）無菌檢驗(yàn)（藥品、醫(yī)療器械、食品的無菌驗(yàn)證）

環(huán)境要求：需在百級(jí)潔凈度的無菌室或隔離器內(nèi)操作，環(huán)境微生物監(jiān)測(cè)（沉降菌法）：每培養(yǎng)皿沉降 30 分鐘，菌落數(shù)≤1cfu / 皿；

樣本處理：藥品/醫(yī)療器械樣本需按《中國(guó)藥典》要求進(jìn)行無菌采樣，采樣工具需滅菌，采樣過程中避免樣本接觸非無菌表面；

培養(yǎng)條件：需同時(shí)設(shè)置陽性對(duì)照（接種已知致病菌，如金黃色葡萄球菌）和陰性對(duì)照（未接種樣本的培養(yǎng)基），培養(yǎng)后觀察對(duì)照組是否正常生長(zhǎng)（陽性對(duì)照需生長(zhǎng)，陰性對(duì)照需無菌落），否則實(shí)驗(yàn)結(jié)果無效；

結(jié)果判斷：若供試品培養(yǎng)后無菌落生長(zhǎng)，且對(duì)照組符合要求，判定為無菌；若有菌落生長(zhǎng)，需進(jìn)一步鑒定是否為污染菌或樣本本身攜帶的微生物。

四、無菌操作的質(zhì)量控制與常見問題解決

（一）質(zhì)量控制指標(biāo)與監(jiān)測(cè)方法

控制指標(biāo)        監(jiān)測(cè)頻率      監(jiān)測(cè)方法      合格標(biāo)準(zhǔn)

環(huán)境空氣潔凈度 每月 1 次 沉降菌法（培養(yǎng)皿暴露 30 分鐘，37℃培養(yǎng) 48 小時(shí)）或粒子計(jì)數(shù)器法 萬級(jí)環(huán)境：沉降菌≤10cfu/皿；百級(jí)區(qū)域（生物安全柜內(nèi)）：沉降菌≤1cfu/皿

器材滅菌效果 每批次滅菌后 生物指示劑法（如嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子片，滅菌后培養(yǎng)，若孢子未生長(zhǎng)則合格） 生物指示劑無生長(zhǎng)，物理指標(biāo)（溫度、壓力、時(shí)間）符合設(shè)定值

操作人員無菌操作規(guī)范性 每周 1 次（盲樣測(cè)試） 操作人員按標(biāo)準(zhǔn)流程操作后，在操作區(qū)放置空白培養(yǎng)基，培養(yǎng)后觀察是否有菌落生長(zhǎng) 空白培養(yǎng)基無菌落生長(zhǎng)，表明操作無污染

培養(yǎng)基無菌性 每批次制備后 取部分培養(yǎng)基培養(yǎng)（37℃，48 小時(shí)），觀察是否有菌落生長(zhǎng) 無菌落生長(zhǎng)，培養(yǎng)基顏色、狀態(tài)正常（無渾濁、無沉淀）

（二）常見問題與解決方案

常見問題             可能原因        解決措施

培養(yǎng)基污染（渾濁、長(zhǎng)菌） 1.滅菌不（溫度/時(shí)間不足、冷空氣未排盡）；2.開蓋后暴露時(shí)間過長(zhǎng)；3.操作人員手套污染 1.重新校準(zhǔn)高壓滅菌鍋，確保溫度 121℃、時(shí)間 20 分鐘，滅菌后排氣 3 分鐘；2.開蓋后 1 分鐘內(nèi)完成接種/分裝；3.操作過程中定期用 75% 乙醇消毒手套，接觸非無菌面后立即更換

樣本交叉污染 1.不同樣本共用吸頭/接種環(huán)；2.樣本處理順序混亂（高濃度樣本污染低濃度樣本） 1.一人一樣本一吸頭，接種環(huán)每次使用后灼燒滅菌；2.按“低濃度→高濃度”順序處理樣本，樣本之間保持一定距離（≥10cm）

細(xì)胞培養(yǎng)支原體污染 1.血清未過濾滅菌；2.培養(yǎng)器材污染；3.操作人員攜帶支原體 1.血清使用前用 0.1μm 濾膜過濾滅菌；2.培養(yǎng)瓶/吸頭選擇無支原體認(rèn)證產(chǎn)品；3.操作時(shí)戴口罩，避免飛沫污染，定期檢測(cè)細(xì)胞支原體

無菌操作后仍有雜菌生長(zhǎng) 1.生物安全柜/超凈工作臺(tái)紫外燈失效；2.實(shí)驗(yàn)環(huán)境濕度超標(biāo)（>60%，利于微生物生長(zhǎng)） 1.定期檢測(cè)紫外燈強(qiáng)度（≥70μW/cm2，否則更換）；2.開啟除濕機(jī)，將環(huán)境濕度控制在 40%-60%；3.增加環(huán)境消毒頻率（如每日用含氯消毒劑擦拭臺(tái)面）

五、關(guān)鍵注意事項(xiàng)與合規(guī)要求

法規(guī)依據(jù)：需符合《GB 4789.1-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 總則》《中國(guó)藥典 2020 年版 四部 無菌檢查法》《ISO 13485 醫(yī)療器械質(zhì)量管理體系》等標(biāo)準(zhǔn)，確保操作合規(guī)；

人員培訓(xùn)：操作人員需經(jīng)系統(tǒng)培訓(xùn)（無菌操作原理、流程、應(yīng)急處理），考核合格后方可獨(dú)立操作；定期開展再培訓(xùn)（每年 1-2 次），更新知識(shí)和技能；

應(yīng)急處理：若發(fā)生樣本泄漏（如病原微生物樣本濺出），立即用含氯消毒劑覆蓋泄漏區(qū)域（作用 30 分鐘），再清理污染物，清理過程中戴雙層手套、護(hù)目鏡，避免感染；

記錄追溯：詳細(xì)記錄每批實(shí)驗(yàn)的 “環(huán)境消毒時(shí)間、滅菌參數(shù)（溫度/壓力/時(shí)間）、操作人員、樣本信息、對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果”，形成完整的追溯鏈條，便于問題排查。

六、總結(jié)

無菌操作的核心是“全程可控、全程無菌”，需從環(huán)境、器材、人員、操作四個(gè)維度建立標(biāo)準(zhǔn)化流程，同時(shí)通過定期監(jiān)測(cè)、盲樣測(cè)試、應(yīng)急演練等方式強(qiáng)化質(zhì)量控制。在實(shí)際檢驗(yàn)工作中，需結(jié)合具體場(chǎng)景（微生物檢驗(yàn)、細(xì)胞培養(yǎng)、無菌驗(yàn)證）的專項(xiàng)要求，靈活調(diào)整操作細(xì)節(jié)，最終實(shí)現(xiàn)“零交叉、結(jié)果可靠”的目標(biāo)。

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