技術(shù)背景

隨著基因組學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組學(xué)作為連接基因組與蛋白組的關(guān)鍵橋梁，在孟德爾疾病的臨床診斷中發(fā)揮著日益重要的作用。轉(zhuǎn)錄組是指某個物種或者特定細(xì)胞類型產(chǎn)生的所有轉(zhuǎn)錄本的集合，而轉(zhuǎn)錄組測序（RNA sequencing，RNA-seq）就是用高通量測序技術(shù)對轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序分析，反映樣本中信使RNA（mRNA）、核糖體RNA（rRNA）、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）及非編碼RNA（ncRNA）的表達(dá)情況。其中針對mRNA的RNA-seq是最·常用的轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)之一，也是在轉(zhuǎn)錄組水平上分析差異基因表達(dá)、mRNA可變剪切和等位基因失衡等問題不·可缺少的工具。

盡管在孟德爾遺傳病的輔助診斷中，全外顯子組測序（WES）和全基因組測序（WGS）已廣泛應(yīng)用，但仍存在20%–50%的病例無法明確診斷。而RNA-seq能夠通過發(fā)現(xiàn)深度內(nèi)含子突變、剪接異常、表達(dá)量變化等DNA層面難以捕捉的信息，提高2%~7.5%的遺傳診斷率，對基于DNA的NGS方法（WES、WGS）提供的信息進(jìn)行補(bǔ)充和擴(kuò)展。

技術(shù)流程

1. Total RNA抽提

高質(zhì)量的 RNA 是整個實(shí)驗(yàn)成功的基礎(chǔ)，因此需要先對抽提總RNA進(jìn)行質(zhì)檢，大致內(nèi)容包括：RNA是否有污染及其降解程度、RNA的純度（OD260/280）、RNA的濃度、RNA的完整性等。

2. 文庫構(gòu)建

得到質(zhì)檢合格的RNA后，進(jìn)行測序文庫的構(gòu)建。首先需要通過磁珠吸附或其它手段富集mRNA；將富集到的mRNA打斷至二代測序要求的長度并反轉(zhuǎn)錄成cDNA；之后經(jīng)過末端修復(fù)、3’加A尾、連接接頭、PCR富集等過程完成測序文庫的構(gòu)建。

3. 上機(jī)測序

構(gòu)建的文庫質(zhì)檢合格后，通過橋式PCR和可逆終止物測序（illumina平臺）獲得下機(jī)原始數(shù)據(jù)。

4. 數(shù)據(jù)分析

對下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，篩選出高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，通過組間比較（需要設(shè)置對照組樣本）著重分析患者樣本中的差異表達(dá)基因和差異可變剪切。

技術(shù)優(yōu)勢

目前NGS應(yīng)用孟德爾遺傳病的輔助診斷中主要是基于DNA層面的檢測（WES、WGS），導(dǎo)致許多類型的突變（如：結(jié)構(gòu)變異、位于基因組非編碼和調(diào)控區(qū)域的致病突變、可變剪切、同義突變等）存在漏檢的情況，并且單從DNA層面很難對那些意義未明（VUS）的突變，以及一些誤判為“良性”的突變進(jìn)行解釋。而RNA-seq有助于上述罕見突變的檢出，并從RNA層面補(bǔ)充和擴(kuò)展基于 DNA 的 NGS 方法提供的輔助診斷信息。

文獻(xiàn)支持

一項(xiàng)研究通過83名WES和WGS未明確診斷的疑似患有孟德爾遺傳病患者進(jìn)行RNA-seq檢測，確診了14名患者（17%）。這表明RNA-seq可以對WES、WGS等檢測方法進(jìn)行補(bǔ)充，提高疾病檢出率，并克服基于DNA層面的基因檢測工具的部分局限性。

買測序相關(guān)試劑耗材，就找紅榮微再生物---專注于分子診斷