如果有人問我，在單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化中，哪個環(huán)節(jié)最讓人頭大？

我的回答一定是：T0代陽性苗的初篩。

那是去年秋天，我們在做玉米（Zea mays）的遺傳轉(zhuǎn)化。

我們將目標(biāo)基因與eGFP融合，通過農(nóng)桿菌侵染幼胚，獲得了再生植株。

按照慣例，我們需要對再生苗進(jìn)行陽性鑒定。

第一個坑：顯微鏡裝不下。

玉米不是擬南芥。擬南芥可以整株壓片，玉米的葉片一旦展開，根本塞不進(jìn)熒光顯微鏡的載物臺。我們只能切根尖、切葉片邊緣，做成臨時裝片。

第二個坑：背景噪聲。

玉米屬于C4植物，葉綠素含量高。在488nm激發(fā)下，葉綠素的自發(fā)熒光（Autofluorescence）強(qiáng)到能把微弱的GFP信號淹沒。我們不得不降低激光功率，增加曝光時間，結(jié)果就是——樣品被紫外烤焦了，信號還沒出來。

那段時間，實驗室里堆滿了切得亂七八糟的玉米葉片，電腦里全是模糊不清的熒光圖。導(dǎo)師問：“苗篩得怎么樣了？”我只能沉默。因為我也沒法確定，那團(tuán)綠光里，到底有沒有我要的GFP。

為了解決這個問題，我們重新審視了篩選方案。

傳統(tǒng)的組織化學(xué)法（GUS染色）需要破壞樣本，且周期長。

共聚焦顯微鏡（Confocal）精度高，但通量極低，且受限于樣本大小。

我們需要一種能對活體大株系進(jìn)行快速篩查的手段。

查閱資料后，我們鎖定了激發(fā)光譜。

eGFP的激發(fā)峰在488nm（藍(lán)光區(qū)域），而葉綠素在紅光區(qū)域（650nm以上）才有強(qiáng)發(fā)射。這意味著，如果我們用高強(qiáng)度的450nm藍(lán)光去激發(fā)，并用截止波長500nm以上的濾光片去觀察，理論上可以過濾掉大部分葉綠素背景。

我們找來了 LUYOR-3415RG（3415系列）雙波段熒光蛋白激發(fā)光源。

這是由 上海儀橙科技 提供的一款便攜式激發(fā)設(shè)備。我們并沒有把它當(dāng)成什么精密儀器，只是把它當(dāng)作一個“高通量過濾器”。

實驗操作非常簡單：

1. 關(guān)閉培養(yǎng)室主燈，營造半暗環(huán)境

2. 手持3415RG，距離玉米苗20-30cm，自上而下掃描。

3. 佩戴配套的LUV系列黃色濾光眼鏡。

結(jié)果直觀。

野生型玉米苗在濾光鏡下幾乎呈黑色（葉綠素背景被過濾），而轉(zhuǎn)基因陽性苗的葉尖或根系，清晰地發(fā)出明亮的綠色熒光。

我們不需要切片，不需要制片，甚至不需要把苗從組培瓶里拿出來（3415RG可以穿透玻璃激發(fā)）。

效率對比：

原本用Confocal篩選一株玉米苗（包括制片和調(diào)試）小半小時

用3415RG，一秒鐘掃一株。

再也不用為了找苗而切葉子了，也不用考慮材料被破壞不必要的數(shù)據(jù)影響了

LUYOR-3415RG 玉米轉(zhuǎn)基因篩選標(biāo)配

• 激發(fā)波段：450nm 高功率藍(lán)光（激發(fā)eGFP/GFP）

• 配套器材：LUV-50 黃色濾光觀察眼鏡（波長500nm，90%不被葉綠素干擾）

• 優(yōu)勢：活體無損、無需暗室、可穿透組培瓶激發(fā)

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