肺纖維化（PF）是一系列慢性、進行性、間質(zhì)性肺疾病，其特征是細胞外基質(zhì)過度沉積，最終導(dǎo)致顯著的發(fā)病率和死亡率，特發(fā)性肺纖維化（IPF）是最常見且臨床意義最qiang的亞型。當(dāng)前研究暗示了 PF 發(fā)病中的修復(fù)機制失調(diào)，特別是以纖維化細胞外基質(zhì)逐漸積累為特征的異常傷口愈合反應(yīng)。這一復(fù)雜過程涉及肺部結(jié)構(gòu)細胞（上皮細胞、內(nèi)皮細胞）與募集的效應(yīng)細胞（免疫群體、激活的成纖維細胞）之間的協(xié)調(diào)相互作用，通過一個不斷演化的可溶介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)（如細胞因子、趨化因子）調(diào)節(jié)細胞間通訊。新出現(xiàn)的證據(jù)表明，肺成纖維細胞和血管細胞之間存在空間鄰接，細胞間通訊失調(diào)推動了纖維化重塑的進展，其強調(diào)了肺部內(nèi)皮細胞（EC）衍生的分子通路是 PF 干預(yù)的新治療靶點。

ECs 利用機械傳感器通過稱為機械轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程來傳導(dǎo)機械刺激。這一生物機制將機械力（如剪切應(yīng)力、循環(huán)拉伸）轉(zhuǎn)化為細胞內(nèi)生化信號，從而誘導(dǎo)染色質(zhì)重塑和轉(zhuǎn)錄重編程。生物力學(xué)應(yīng)力協(xié)調(diào)了涵蓋血管生成、細胞凋亡調(diào)控、炎癥反應(yīng)和血管活性介質(zhì)產(chǎn)生、與生理適應(yīng)和病理進展相關(guān)的失調(diào)等關(guān)鍵內(nèi)皮功能。細胞外基質(zhì)（ECM）傳遞的細胞牽引力形成相互機械反饋，ECM 硬度擾亂機械敏感信號級聯(lián)反應(yīng)，最終損害疾病狀態(tài)下的 EC 功能可塑性。病理性 ECM 積累—纖維化重塑的標志—很可能在肺泡形態(tài)發(fā)生過程中破壞機械穩(wěn)態(tài)，從而改變肺血管機械生物學(xué)。然而，異常機械信號與肺血管功能障礙之間的精確分子機制仍未wanquan確定。

鑒于此，四川大學(xué)華西醫(yī)院高原醫(yī)學(xué)中心、廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸疾病國家重點實驗室、深圳灣實驗室化學(xué)生物學(xué)研究所等研究團隊通過對 IPF 患者肺組織進行單核 RNA 測序（snRNA-seq）分析，發(fā)現(xiàn)了與纖維化進展相關(guān)的ECs中的機械敏感轉(zhuǎn)錄特征；多組學(xué)分析展示了肺血管內(nèi) PIEZO1 機械轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的病理性上調(diào)；機制研究也顯示，PIEZO1 的活化通過 CAPN2/STAT3 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活誘導(dǎo)內(nèi)皮 IL33 分泌，確立了該機械化學(xué)軸作為成纖維細胞激活的驅(qū)動因子。這些發(fā)現(xiàn)確立了通過 PIEZO1-IL33 信號的內(nèi)皮機械轉(zhuǎn)導(dǎo)作為肺纖維化干預(yù)的藥物靶點。研究成果發(fā)表于 Nature Communications 頂刊題為“Single-cell multiomics uncovers an endothelial mechanosensitive PIEZO1-IL-33 axis driving pulmonary fibrosis”。

首先，收集四名特發(fā)性肺纖維化（IPF）肺移植者及五名非IPF正常對照組的肺組織，進行單核RNA測序（snRNA-seq），并從IPF患者和正常對照組獲取細胞研究了15個細胞亞群。特發(fā)性肺纖維化的主要指標是用力肺活量（FVC）下降，鑒于FVC ≤ 50% 預(yù)示著嚴重肺功能障礙和顯著生理損害，因此確定FVC的50% 作為診斷閾值。受試者被分為兩種表型：FVC ≤ 50% 者為FVC-低表型（FLP），F(xiàn)VC > 50% 者為FVC-高表型（FHP），數(shù)據(jù)分析表明，F(xiàn)LP ECs在整體細胞群中比例最高。界定與肺纖維化進展期間嚴重肺功能障礙相關(guān)的ECs中的異常信號通路，基因集評分顯示，IPF組機械應(yīng)力（MS）信號通路顯著上調(diào)。

為進一步驗證上述發(fā)現(xiàn)，研究人員擴大了樣本量，分析顯示，ECs的機械應(yīng)力評分與樣本纖維化評分呈正相關(guān)。此外，還關(guān)注了機械應(yīng)力是否導(dǎo)致IPF的進展，發(fā)現(xiàn)IPF患者肺細胞中機械應(yīng)力普遍增加。GEO數(shù)據(jù)集的薈萃分析驗證了IPF患者的ECs表現(xiàn)出相對較高的機械應(yīng)力，且機械應(yīng)力評分與總成纖維細胞中肌成纖維成細胞的百分比及成纖維細胞標志物之間呈正相關(guān)。這些結(jié)果表明，ECs中異常升高的機械應(yīng)力與PF的發(fā)生有關(guān)。

硅肺病是因吸入大量二氧化硅（SiO?）粉塵而引起的職業(yè)性PF的一種。為了確定PF中的ECs是否表現(xiàn)出機械應(yīng)力升高，通過氣管灌注SiO? 建立了硅肺小鼠模型，H&E和Masson染色結(jié)果顯示，PF小鼠模型中SiO?誘導(dǎo)顯著的間質(zhì)性肺纖維化（圖1 A、B）。

經(jīng)SiO?處理和生理鹽水處理小鼠的質(zhì)量評估和篩選，scRNA測序?qū)?9048個細胞聚集在一起，并根據(jù)標記基因表達識別出肺組織中的主要細胞類型，UMAP圖顯示了肺細胞亞群，包括內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、平滑肌細胞（SMC）和成纖維細胞等（圖1 C）。此外，還使用R軟件包“Seurat”分析了包含26575個細胞的scATAC-seq數(shù)據(jù)集預(yù)測細胞類型（圖1 D）。通過scATAC-seq和scRNA-seq在小鼠肺組織中鑒定了SiO?處理后的細胞亞型標志物（圖1 E-F）。為研究ECs中差異調(diào)控的信號通路，對scRNA-seq數(shù)據(jù)集的ECs進行了Go分析和MS評分，發(fā)現(xiàn)SiO?處理小鼠的ECs顯示出升高的機械轉(zhuǎn)導(dǎo)信號（圖1 G-I）。還分析了 SiO? 處理和生理鹽水處理小鼠的 scATAC-seq 數(shù)據(jù)集中 ECs 的不同峰值，顯示 SiO? 處理組機械應(yīng)力評分有所上升（圖1 J-L ）。

分析ECs中機械應(yīng)力相關(guān)基因的富集情況（圖1 M），觀察到中心基序包括Sox9、Stat1、Ets1、Fosl1、Fos、Etv1、Rela、Neurog1、Meis2、Pparg、Jun、Gata4、Foxp2、Nfkb1和Irf1（圖1 N）。這些結(jié)果證實了ECs中異常機械敏感信號通路在職業(yè)性PF發(fā)病機制中的關(guān)鍵作用。

圖1      單細胞多組學(xué)分析顯示SiO2誘導(dǎo)小鼠PF模型中ECs機械應(yīng)力升高。

博來霉素（BLM）誘導(dǎo)的肺纖維化（PF）小鼠被廣泛用作研究PF的動物模型。為進一步驗證上述發(fā)現(xiàn)，采集了BLM處理小鼠的肺組織，進行單細胞多組學(xué)研究。進一步確定EC 機械敏感通路中哪一個特定基因可能促成PF的進展，數(shù)據(jù)分析確定了機械敏感的Piezo1和Piezo2可能作為參與PF發(fā)病機制的候選基因。隨后分析了ECs中所有機械應(yīng)力相關(guān)基因的峰值，發(fā)現(xiàn)ECs峰值活性增加主要包括Piezo1和Piezo2。有趣的是，在BLM處理的小鼠的ECs中，Piezo1表達有所增加，Piezo2則表現(xiàn)出相反的表達模式。

與上述發(fā)現(xiàn)一致的是，對小鼠模型進行免疫熒光分析顯示，BLM處理小鼠肺內(nèi)皮細胞中Piezo1表達顯著上調(diào)。進一步驗證了在人類樣本中的發(fā)現(xiàn)，Piezo1主要在血管ECs中表達，而Piezo2則在淋巴ECs中優(yōu)先表達。與對照組相比，IPF組中Piezo1+ 細胞顯著增加，而Piezo2+ 細胞則無顯著變化。使用IPF患者和正常對照進行免疫熒光驗證，確認IPF血管ECs中Piezo1 表達顯著上調(diào)。因此，研究人員選擇了 Piezo1 作為功能驗證的有力干預(yù)靶點。

接下來，使用他莫昔芬誘導(dǎo)的EC特異性CreERT2系統(tǒng)在成年小鼠血管細胞中敲除Piezo1（Piezo1ΔEC），觀察到 Piezo1 在肺血管內(nèi)皮細胞中顯著敲低（圖2 A-B）。Masson染色、PSR 染色和H&E染色顯示了Piezo1ΔEC 小鼠膠原蛋白沉積和炎癥的顯著減少（圖2 C）。α-平滑肌肌動蛋白（αSMA）免疫熒光染色進一步驗證了Piezo1 缺失對ECs肺纖維化的抑制作用（圖2 D）。在這些Piezo1ΔEC 小鼠中使用BLM誘導(dǎo)肺纖維化觀察到肺組織中羥脯氨酸（?Hydroxyproline?）顯著減少（圖2 E）。

給藥 Piezo1 激動劑 Yoda1，發(fā)現(xiàn)與生理鹽水對照組相比，Yoda1 的氣管內(nèi)和腹腔內(nèi)給藥均導(dǎo)致小鼠肺部炎癥細胞和纖維化增加。應(yīng)用拮抗劑和激動劑繼續(xù)探討 Piezo1 是否是 PF 的潛在治療靶點（圖2 F）。組織病理染色和羥基脯氨酸檢測顯示，拮抗劑 GsMTx4 減少了纖維化肺組織中羥基脯氨酸的產(chǎn)生以及 ECM 和膠原蛋白的沉積，表明 GsMTx4 能有效緩解 PF，而激動劑 Yoda1 則加劇了 BLM 誘導(dǎo)的 PF 小鼠模型中的纖維化反應(yīng)（圖2 G-I）。重要的是，Yoda1 在接受 BLM 處理的內(nèi)皮特異性 Piezo1 敲除小鼠中未能加重纖維化，證實了 Yoda1 的促纖維化效應(yīng)是通過內(nèi)皮 Piezo1 介導(dǎo)的。

這些數(shù)據(jù)表明，在 ECs 中靶向 Piezo1 可抑制肺纖維化的發(fā)展，強調(diào)了 Piezo1 作為 PF 治療干預(yù)開發(fā)的有前景靶點。

圖 2       PIEZO1的基因缺失和藥物干預(yù)影響PF的發(fā)展。

最新研究表明，ECs通過旁分泌和近分泌兩種機制在肺纖維化的發(fā)病過程中起著至關(guān)重要的作用，通過多種生物活性分子，特別是細胞因子和趨化因子的分泌介導(dǎo)。值得注意的是，新興證據(jù)表明異常機械應(yīng)力在病理過程中會顯著影響這些介質(zhì)從ECs中的釋放?；谶@些發(fā)現(xiàn)，研究人員提出了一個新假說，即異常機械應(yīng)力通過調(diào)節(jié) ECs 中促纖維化因子的分泌，促進 PF 的進展。

為進一步探索對機械應(yīng)力敏感且受 Piezo1 信號調(diào)控的下游促纖維化因子，分析了 scRNA-seq 數(shù)據(jù)，顯示 IGFBP5、IL33、MGP、SPRY1 和 ACKR1 在 ECs 中特異性表達，這些基因與機械應(yīng)力評分表現(xiàn)出顯著相關(guān)性。然而， Piezo1 的表達僅與 IL33 和 ACKR1 的表達呈正相關(guān)。鑒于ACKR1不被歸類為細胞因子，因此選擇IL33作為該研究的最終治療靶點。IL33在ECs中特異且高度表達，IPF組IL33顯著上調(diào)。snRNA-seq數(shù)據(jù)集的Violin圖顯示，Piezo1+ 細胞的IL33表達顯著高于Piezo1- 細胞，IPF組的Piezo1+ ECs表現(xiàn)出高于對照組的IL33表達水平。此外，BLM處理小鼠ECs中IL33表達也上調(diào)。免疫熒光染色顯示，Yoda1增強了IL-33表達，而GsMTx4則有相反效果。免疫熒光分析進一步證實，ECs中特異性缺失Piezo1顯著降低IL-33表達，強化了Piezo1激活調(diào)控ECs中IL33分泌的假說。

為確定ECs中的IL33是否對PF發(fā)展至關(guān)重要，特異性刪除ECs中的IL33，并應(yīng)用BLM創(chuàng)建肺纖維化小鼠模型（圖3 A），IL33的mRNA和蛋白通過Vecad-Cre/LoxP在ECs中有效刪除（圖3 B）。使用Masson、PSR、H&E和αSMA染色和羥脯氨酸測定法的后續(xù)分析表明，在BLM誘導(dǎo)的PF小鼠模型中，IL33 ΔEC 小鼠的纖維化反應(yīng)明顯低于IL33 WT小鼠（圖3 C-E）。

進一步構(gòu)建具有EC特異性IL33過表達（OE-IL33）的Piezo1 ΔEC小鼠模型，隨后進行BLM處理（圖3 F），IL33的mRNA和蛋白水平確認了肺組織中IL33的過表達（圖3 G）。如預(yù)期，ECs中Piezo1的特異性缺失緩解了肺纖維化，但這一效應(yīng)被AAV-IL33在ECs中特異性高表達所顯著逆轉(zhuǎn)（圖3 H-J）。這些體內(nèi)功能修復(fù)實驗表明，內(nèi)皮Piezo1的激活以IL33依賴性方式促進了PF的發(fā)展。

圖3      內(nèi)皮PIEZO1調(diào)控肺纖維化需要IL-33。

最后，利用原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）研究了 Piezo1 對 IL33 表達的調(diào)控機制。由于細胞張力和基質(zhì)硬度變化都可激活 Piezo1 通道，因此，使用細胞拉伸裝置對 HUVECs 單層施加張力，并在不同硬度的底物上培養(yǎng) HUVECs，模擬 Piezo1 的自發(fā)激活。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)受 20% 應(yīng)變時，HUVECs 中 IL33 的分泌和 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在6小時內(nèi)最初上升，24小時后下降，同時，在 25 kPa 底物上培養(yǎng)的單層 HUVECs 表現(xiàn)出更高的 IL-33 分泌和轉(zhuǎn)錄表達水平（圖4 A-B）。值得注意的是，在細胞接受 20% 張力6小時或在 25 kPa 底物上培養(yǎng)后，用 shRNA 沉默 HUVECs Piezo1 表達，抑制了 IL-33 的分泌和轉(zhuǎn)錄（圖4 C-E）。

CAPN2 作為 Piezo1 介導(dǎo)機械轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵下游效應(yīng)因子，參與多種機械響應(yīng)的生物過程。有趣的是，經(jīng)過 20% 幅度的拉伸和 25 kPa 底物培養(yǎng)后，Calpain2 的活性和蛋白質(zhì)水平均顯著增加，趨勢與 IL-33 相似（圖4 F、G），這些效應(yīng)被 Piezo1 敲低抑制（圖4 H、I）。因此，可推測 Piezo1 激活誘導(dǎo)的IL33 依賴于CAPN2。與假設(shè)一致，CAPN2 敲低（shCAPN2）在機械刺激下顯著降低 IL-33 的表達和分泌（圖4 J、K）。

轉(zhuǎn)錄因子（TFs）是結(jié)合啟動子區(qū)域并直接啟動靶基因表達所必需的。為了探討哪些 TFs 作為 PIEZO1-CAPN2 軸的下游分子調(diào)控 IL-33 表達（圖4 L），利用了 Cistrome 公開轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫，預(yù)測了可能調(diào)控 IL33 表達的前shi大轉(zhuǎn)錄因子（圖4 M）。此外，利用纖維化小鼠模型的 scATAC-seq 數(shù)據(jù)集對 ECs 中差異峰進行了基序富集分析，并確定出內(nèi)皮表達量最高的 100 個基序（圖4 N）。Venn 圖分析表明，STAT3 是機械力作用下調(diào)節(jié) IL33 表達的關(guān)鍵 TFs（圖4 N）。重要的是，6小時的機械拉伸明顯促進了 STAT3 的激活，這一點通過 p-STAT3 免疫印跡法顯示（圖4 O），這種拉伸誘導(dǎo)的激活被 Piezo1 和 CAPN2 的沉默阻斷（圖4 P）。這些結(jié)果表明，STAT3 可能作為 Piezo1 的下游 TF，參與 IL33 表達的調(diào)控。在機械刺激條件下（循環(huán) 20% 拉伸應(yīng)變和 25 kPa 底物硬度）培養(yǎng)的 HUVECs 中，STAT3 敲低（shSTAT3）顯著減弱了 IL33 轉(zhuǎn)錄本水平和蛋白質(zhì)分泌（圖4 Q、R）。

這些數(shù)據(jù)表明，內(nèi)皮 Piezo1 的激活誘導(dǎo)下游前纖維化分子 IL-33 調(diào)控 PF 的發(fā)展，可能通過 CAPN2-STAT3 軸。

圖4     CAPN2-STAT3軸調(diào)節(jié)PIEZO1激活時IL-33的表達。

總之，通過在 BLM/SiO? 誘導(dǎo)小鼠模型中進行跨物種驗證和 scRNA-seq 確認，該研究確立了內(nèi)皮PIEZO1作為纖維化重塑中中樞機械轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的地位。機制研究顯示，PIEZO1 介導(dǎo)的鈣通量激活 CAPN2 依賴的 STAT3 磷酸化，可能觸發(fā) IL-33 分泌，通過旁分泌信號維持成纖維細胞激活。這些結(jié)果使內(nèi)皮 PIEZO1-CAPN2-STAT3-IL33 軸成為具有治療PF潛力的機化學(xué)信號。

但該研究也缺乏關(guān)于 ECs 與其他細胞之間細胞串?dāng)_的研究。IL-33，一種 EC 衍生的壞死因子，可能在 PF 發(fā)育過程中激活血管周圍成纖維細胞和巨噬細胞，因此需要進行共培養(yǎng)實驗來探討此事。盡管仍需更多研究，該研究工作仍然闡明了 ECs 中異常機械應(yīng)力的分子和細胞節(jié)點，有望助力發(fā)現(xiàn)治療纖維化疾病的新候選療法。

參考文獻：Zhang L, Gui X, Hou R, Jia L, Xia S, Zhang X, Fu Y, Meng QF, Luo Q, Shi X, Guo B, Liang R, Yue L, Chen X, Xu H, Wang P, Tong X, Liu L, Wang L, Li B, Chen Z, Zhou L, Zhang L, Chen R, Sun C, Xu W, Rao L, Zhou H, Ding BS, Chen S. Single-cell multiomics uncovers an endothelial mechanosensitive PIEZO1-IL-33 axis driving pulmonary fibrosis. Nat Commun. 2026 Mar 20;17(1):2655. doi: 10.1038/s41467-026-70193-w. PMID: 41862476; PMCID: PMC13004862.

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