3-磷酸甘油酸激酶（PGK）活性檢測試劑盒

（紫外分光光度法）

注意：正式測定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

產(chǎn)品貨號(hào)：BA1003

產(chǎn)品規(guī)格：50管/48樣

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體60mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體25mL×1瓶，4℃避光保存；

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨用前加5mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑三：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨用前加2.5 mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑四：粉劑×3支，-20℃避光保存。臨用前加1mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑五：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨用前加10 mL蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

產(chǎn)品說明：

3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的關(guān)鍵酶，也是生物得以生存的關(guān)鍵酶。廣泛存在于動(dòng)植物和微生物體內(nèi)，具有影響DNA復(fù)制和修補(bǔ)及刺激病毒RNA合成等生物學(xué)功能，廣泛應(yīng)用于藥物靶標(biāo)設(shè)計(jì)。

3-磷酸甘油酸激酶催化3-磷酸甘油酸和ATP產(chǎn)生1,3-二磷酸甘油酸和ADP，1,3-二磷酸甘油酸在3-磷酸甘油醛脫氫酶和NADH作用下產(chǎn)生3-磷酸甘油醛、NAD和磷酸，引起340nm處的吸光度下降，即反映了3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、低溫臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、1mL石英比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、粗酶液提?。?/span>

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后10000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1 的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后10000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

血清/血漿：直接檢測。

二、測定步驟：

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 工作液的配制：按照蒸餾水：試劑一：試劑二：試劑三：試劑四：試劑五=6:10:2:1:1:4 的體積比例充分混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。

3、 操作表：在1mL石英比色皿中分別加入下列試劑：

三、PGK 活性計(jì)算：

（1）按照樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PGK（U/mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷(V樣×Cpr) ÷T＝321.54×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗 1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PGK（U/g 鮮重）＝ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷(W×V樣÷V樣總) ÷T＝321.54×ΔA÷W

（3）按液體體積計(jì)算：

酶活單位定義：每mL血清（漿）每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PGK（U/g 鮮重）＝ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷V樣÷T＝321.54×ΔA÷W

（4）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：

酶活單位定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PGK（U/g 鮮重）＝ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷(500×V樣÷V樣總)÷T＝0.643×ΔA÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-3L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；

V樣：加入樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：500萬個(gè)細(xì)胞；10⁹：單位換算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。

注意事項(xiàng)：

1、△A大于0.8或者A1測定小于0.9時(shí)，建議將粗酶液用提取液稀釋后再進(jìn)行測定。當(dāng)△A小于0.01時(shí)，可以延長反應(yīng)時(shí)間（10min或15min）或增加樣本體積來測定。

2、空白管為檢測各試劑組分質(zhì)量的檢測孔，正常情況下，變化不超過0.01。

3、樣品的蛋白濃度需自行測定，由于提取液中含有較高的蛋白濃度（約10mg/mL），所以測定樣品蛋白濃度時(shí)需扣除提取液自身蛋白濃度。