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非洲豬瘟單克隆抗體制備實驗進程
非洲豬瘟（英文名稱：Infection with African swine fever virus，簡稱：ASF）是由非洲豬瘟病毒（英文名稱：African Swine fever virus，簡稱：ASFV）感染家豬和各種野豬（如非洲野豬、歐洲野豬等）而引起的一種急性、出血性、烈性傳染病。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定報告動物疫病，該病也是我國重點防范的一類動物疫情。
非洲豬瘟臨床癥狀與豬瘟癥狀相似，只能依靠實驗室監(jiān)測確診。
加入免疫抗體100µL /孔， 輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應20min。
小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加入洗滌工作液250µL/孔，每次靜置20s，甩去孔內液體，重復洗滌3次，最后一次用吸水紙拍干。
再加入酶標物100µL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應20min。
小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加入洗滌工作液250µL/孔，每次靜置20s，甩去孔內液體，重復洗滌3次，最后一次用吸水紙拍干。
加入底物液A液50µL/孔，再加底物顯色液B液50µL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應10min。
結果及結論見下表：
加入酶標物50µL /孔， 再加入細胞上清50µL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應30min。
小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加入洗滌工作液250µL/孔，每次靜置20s，甩去孔內液體，重復洗滌3次，最后一次用吸水紙拍干。
加入底物液A液50µL/孔，再加底物顯色液B液50µL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應10min。
結果見下圖：
結論：共選62個陽性孔的細胞進行抗體特異性測定。
加入酶標物50µL /孔， 再加入細胞上清50µL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應30min。
小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加入洗滌工作液250µL/孔，每次靜置20s，甩去孔內液體，重復洗滌3次，最后一次用吸水紙拍干。
加入底物液A液50µL/孔，再加底物顯色液B液50µL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應10min。
結果見下圖：
共選出14株效價高、抗體特異性好的細胞進行第一次亞克隆。
株號有：2C4 3B9 3D6 3F10 4D1 4F4 5D2 5D4 5D7 7D4 7D7 7C8 8G10 4F10
加入酶標物50µL /孔， 再加入細胞上清50µL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應30min。
小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加入洗滌工作液250µL/孔，每次靜置20s，甩去孔內液體，重復洗滌3次，最后一次用吸水紙拍干。
加入底物液A液50µL/孔，再加底物顯色液B液50µL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應10min。
結果見下圖：
結論：共選出10株效價高的細胞進行第二次亞克隆。
株號有：2C4 3D6 3F10 4F4 5D2 5D4 5D7 7D4 8G10 4F10
加入酶標物50µL /孔， 再加入細胞上清50µL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應30min。
小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加入洗滌工作液250µL/孔，每次靜置20s，甩去孔內液體，重復洗滌3次，最后一次用吸水紙拍干。
加入底物液A液50µL/孔，再加底物顯色液B液50µL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應10min。
結果見下圖：
結論：經顯微鏡觀察，有四株細胞100%純陽性（5D2 5D4 5D7 3F10）擴大并凍存； 有六株細胞細胞進行第三次亞克隆。
三次亞克隆株號有：2C4 3D6 4F4 7D4 8G10 4F10
加入酶標物50µL /孔， 再加入細胞上清50µL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應30min。
小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加入洗滌工作液250µL/孔，每次靜置20s，甩去孔內液體，重復洗滌3次，最后一次用吸水紙拍干。
加入底物液A液50µL/孔，再加底物顯色液B液50µL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應10min。
結果見下圖：
結論：共選出10株效價高的細胞進行第二次亞克隆。經顯微鏡觀察，有四株細胞100%純陽性（8G10 2C4 4F4 7D4 ）擴大并凍存；4F10和3D6株細胞轉陰性，扔之。
將篩選到的非洲豬瘟8株單抗，制備腹水并測腹水效價。
加入酶標物50µL /孔， 再加入稀釋后的抗體50µL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應30min。
小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加入洗滌工作液250µL/孔，每次靜置20s，甩去孔內液體，重復洗滌3次，最后一次用吸水紙拍干。
加入底物液A液50µL/孔，再加底物顯色液B液50µL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環(huán)境中反應10min。
結果及結論見下表：
ASFV共8株Ab，各按生產條件標記1條金墊后測試結果。
標記：1號.2C4 2號.3F10 3號.4F4 4號.5D2 5號.5D4 6號.7D4 7號.8G10 8號.混合 9號.兔多抗。
劃線：用9株Ab同時劃9種T線，1/1稀釋，稀釋液是動物CB液。
1-8號單抗；T線：兔多抗劃線1:1（動物包被液稀釋）。
最初先用 1-8號金條和兔多抗1：1 劃線測試陽性病料（1:5，用2*樣稀稀釋，非處理樣品墊），如下圖，8-10分觀察，結論：爬速過快，需要調整爬速。
接著用 1-8號金條和兔多抗1：1 劃線測試陽性病料（1:5，用1*樣稀稀釋，非處理樣品墊），8-10分觀察，如下圖：
結論如下表：
1-8號金條與兔多抗1：1 測試陽性結果。
繼續(xù)優(yōu)化實驗方案，用 1-8號金條和兔多抗1：1 分別測試陽性病料（1:5，用1*樣稀稀釋，用濾血膜）和豬陰性血清（1:5，用1*樣稀稀釋），8-10分觀察，分別如下圖：
多次實驗結論：1,2,3,4,5,8,號抗體與兔多抗（1：1）反應，6,7號抗體與兔多抗（1：1）無反應。并重復復核實驗1,2,3,4,5,8,這六種抗體與兔多抗的反應，如下圖，證明結論正確。
9號兔多抗標記；T線：1，2，3,4,5,8號單抗1：1（動物包被液稀釋）。
陽性見下圖
陰性見下圖
結論1,2號抗體最好。
9號兔多抗標記金條與1，2，3,4,5,8號抗體劃線測試陰陽性結果
1號.2C4 2號.3F10 3號.4F4
4號.5D2 5號.5D4 8號.混合
1號抗體標記金條，依次為2 3 4 5 8號抗體1：1劃線，測試陽性（病料1:5稀釋，用1*樣稀），見下圖：
測試陰性（豬血清1:5，用1*樣稀），結果見下圖：
2號抗體標記金條，依次為1 3 4 5 8號抗體1：1劃線，測試陽性（病料1:5稀釋，用1*樣稀），見下圖：
測試陰性（豬血清1:5，用1*樣?。?，結果見下圖：
3號抗體標記金條，依次為1 2 4 5 8號抗體1：1劃線，測試陽性（病料1:5稀釋，用1*樣?。?，見下圖：
測試陰性（豬血清1:5，用1*樣?。Y果見下圖：
4號抗體標記金條，依次為1 2 3 5 8號抗體1：1劃線，測試陽性（病料1:5稀釋，用1*樣稀），見下圖：
測試陰性（豬血清1:5，用1*樣?。Y果見下圖：
5號抗體標記金條，依次為1 2 3 4 8號抗體1：1劃線，測試陽性（病料1:5稀釋，用1*樣稀），見下圖：
測試陰性（豬血清1:5，用1*樣?。?，結果見下圖：
8號抗體標記金條，依次為1 2 3 4 5號抗體1：1劃線，測試陽性（病料1:5稀釋，用1*樣稀），見下圖：
測試陰性（豬血清1:5，用1*樣?。?，結果見下圖：
實
驗
結
論
經重復觀察實驗，以下四組單抗交叉配對效果較好。
2號抗體（3F10）標記配對3號抗體（4F4 ）劃線
2號抗體（3F10）標記配對8號抗體（8株混合后）劃線
3號抗體（4F4 ）標記配對4號抗體（5D2）劃線
3號抗體（4F4 ）標記配對8號抗體（8株混合后）劃線
經進一步調試，2,5,6,7,20經PCR測定陽性的，試紙條測試液為陽性，其他為陰性，符合率100%。
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