GFP轉(zhuǎn)基因擬南芥的培養(yǎng)及熒光觀察

實驗原理：
1.GFP報告基因
 全稱為綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein， GFP），簡稱GFP，20世紀(jì)60年代在水母中發(fā)現(xiàn)的發(fā)光蛋白。由238氨基酸組成的單鏈多肽，在藍(lán)光或紫外光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光，用于蛋白質(zhì)在活細(xì)胞中的準(zhǔn)確定位及動態(tài)變化觀察（分泌蛋白的分選、亞細(xì)胞定位）
2.目的基因
MAP65-1，是一種微管結(jié)合蛋白，可以根據(jù)擬南芥葉片表皮細(xì)胞、保衛(wèi)細(xì)胞，下胚軸和根部細(xì)胞中微管骨架的分布情況來推斷目的基因是否存在。
3.表達(dá)載體：
植物表達(dá)載體的構(gòu)建→導(dǎo)入農(nóng)桿菌自我復(fù)制→浸染花粉轉(zhuǎn)入擬南芥； 卡那霉素抗性培養(yǎng)基篩選，
卡那霉素:
抗生素
影響植物細(xì)胞葉綠體和線粒體的蛋白合成,引起植株黃化死亡.卡那霉素能對轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行篩選實質(zhì)上是通過卡那霉素抗性基因起作用的。轉(zhuǎn)基因植物由于含有卡那霉素抗性基因而抑制了卡那霉素的作用，所以通過卡那霉素,轉(zhuǎn)化體就很容易從非轉(zhuǎn)化體中篩選出來。

GFP轉(zhuǎn)基因植株 野生型植株 GFP轉(zhuǎn)基因植株 轉(zhuǎn)基因植株
1/2MS培養(yǎng)基 1/2MS卡那抗性培養(yǎng)基

實驗材料：
GFP轉(zhuǎn)基因擬南芥種子及野生型種子；1/2MS培養(yǎng)基 ；1/2MS卡那抗性培養(yǎng)基； 75％乙醇；10％NaClO；無菌水。

實驗步驟：
1.種子春化（ 加蒸餾水放入4℃冰箱中過夜）；
2.751min（混勻，盡量將液體吸凈，動作要快）；
3.10％xiaodu10min （混勻，盡量將液體吸凈，動作要快）；
4. 無菌水洗三遍，用牙簽將種子點在培養(yǎng)基表面（每皿4-5顆種子 盡量均勻）；
5.封膜，做好標(biāo)記，平放于培養(yǎng)架上培養(yǎng)。

實驗結(jié)果：
少等長勢不優(yōu)良的現(xiàn)象，是因為野生型不存在卡那抗性基因，而轉(zhuǎn)基因植株存在卡那抗性基因，所以可以將轉(zhuǎn)基因植株在卡那抗性培養(yǎng)基中篩選出來；在轉(zhuǎn)基因擬南芥中，熒光標(biāo)記在不同位置亮度效果不同，我們認(rèn)為可能是與不同位置微管分布情況和微管結(jié)合蛋白對不同位置的結(jié)合效果不同有關(guān)。

注意事項：
嚴(yán)格無菌操作.
xiaodu過程動作要快.
槍頭不要重復(fù)使用，物品不要拿出超凈臺.
點種時每個位置盡量只點一顆子.
操作時盡量避免說話和人員走動.
注意小組內(nèi)的配合和小組間的協(xié)調(diào).

思考題：
1 .本實驗用的了兩種培養(yǎng)基，有何不同？主要作用是什么？
 實驗中分別用到了1/2MS培養(yǎng)基和1/2MS卡那抗性培養(yǎng)基。MS培養(yǎng)基是一種常用的植物組織培養(yǎng)基；在1/2MS培養(yǎng)基中無機鹽為MS培養(yǎng)基的一半。但在1/2MS卡那抗性培養(yǎng)基中添加了一種抗生素—卡那霉素?？敲顾啬軐D(zhuǎn)基因植物進(jìn)行篩選實質(zhì)上是通過卡那霉素抗性基因起作用的。轉(zhuǎn)基因植物由于含有卡那霉素抗性基因而抑制了卡那霉素的作用，所以通過卡那霉素,轉(zhuǎn)化體就很容易從非轉(zhuǎn)化體中篩選出來。
2.什么是GFP? 在生物學(xué)研究中有何用途？
GFP是綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein， GFP），簡稱GFP，20世紀(jì)60年代在水母中發(fā)現(xiàn)的發(fā)光蛋白。由238氨基酸組成的單鏈多肽，在藍(lán)光或紫外光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光，可以起到標(biāo)記目的基因的作用。
3.GFP主要使用什么顏色的激發(fā)光？你觀察到得熒光是什么顏色？
GFP在藍(lán)光或紫外光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光、

標(biāo)注：

在植物分子生物學(xué)研究中，綠色熒光蛋白（GFP）作為報告基因，被廣泛應(yīng)用于目的基因的亞細(xì)胞定位和轉(zhuǎn)基因植株的陽性篩選。本文以擬南芥為模式植物，介紹從種子消毒、抗性篩選到活體熒光觀察的完整實驗流程。

1. 實驗原理

GFP（Green Fluorescent Protein）源自維多利亞多管水母，是由238個氨基酸組成的單鏈多肽，在藍(lán)光或紫外光激發(fā)下可發(fā)出綠色熒光。實驗中，我們將微管結(jié)合蛋白基因 MAP65-1 構(gòu)建至植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入擬南芥。利用 卡那霉素抗性基因 作為篩選標(biāo)記，在含卡那霉素的培養(yǎng)基上，未轉(zhuǎn)化的野生型植株因蛋白合成受阻而黃化死亡，轉(zhuǎn)化植株則能正常生長，從而實現(xiàn)陽性苗的初步篩選。

2. 實驗材料

GFP轉(zhuǎn)基因擬南芥種子及野生型對照；1/2 MS培養(yǎng)基；1/2 MS卡那霉素抗性培養(yǎng)基；75%乙醇；10% NaClO；無菌水。

3. 實驗步驟

1. 
   

   春化與消毒：將種子置于無菌水中，4℃冰箱春化過夜。取出后依次用75%乙醇處理1 min、10% NaClO處理10 min進(jìn)行消毒，期間需不斷混勻。

   
   

2. 
   

   清洗與播種：消毒結(jié)束后盡量吸凈液體，用無菌水清洗3遍。用牙簽將種子點播于培養(yǎng)基表面（每皿4-5粒，分布均勻），封膜并做好標(biāo)記。

   
   

3. 
   

   培養(yǎng)：將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)架上進(jìn)行垂直或水平培養(yǎng)，定期觀察生長情況。

   
   

4. 熒光觀察

培養(yǎng)一段時間后，野生型植株在卡那霉素培養(yǎng)基上會逐漸黃化枯萎，而轉(zhuǎn)基因陽性植株長勢良好。此時，可利用手持式熒光蛋白激發(fā)光源（如LUYOR-3415系列，選用450nm左右波段）對植株進(jìn)行照射。配合專用濾光眼鏡，可在非暗室條件下直接觀察到轉(zhuǎn)基因植株發(fā)出的明亮綠光，進(jìn)一步確認(rèn) MAP65-1 基因在根、下胚軸及葉片表皮細(xì)胞中的表達(dá)情況。