志賀氏菌檢測(cè)抗原的準(zhǔn)備原則與操作步驟及質(zhì)控與注意事項(xiàng)!
百歐博偉生物:志賀氏菌檢測(cè)的抗原準(zhǔn)備核心是制備純、鮮、濃的菌懸液,以 O 抗原為主,排除 K 抗原干擾,符合玻片凝集試驗(yàn)的質(zhì)量要求。
一、抗原準(zhǔn)備總原則
志賀氏菌無(wú)鞭毛抗原,主要檢測(cè)菌體 O 抗原(群/型特異性);部分菌株含 K 抗原(表面抗原),會(huì)遮蔽 O 抗原,需去除以避免假陰性。
標(biāo)準(zhǔn)要求:1.2%~1.5% 瓊脂斜面的新鮮純培養(yǎng)物為,必要時(shí)制備濃菌液并加熱去 K 抗原。
二、材料與設(shè)備
培養(yǎng)基:營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面(1.2%~1.5% 瓊脂)
試劑:0.9% 無(wú)菌生理鹽水;100℃沸水?。ㄓ糜谌?K 抗原)
設(shè)備:潔凈載玻片、接種環(huán)/針、酒精燈、試管、計(jì)時(shí)器、黑色背景觀察臺(tái)
對(duì)照:志賀氏菌屬診斷血清(多價(jià) + 群/型單價(jià));生理鹽水自凝對(duì)照
三、標(biāo)準(zhǔn)操作步驟(GB 4789.5-2012)
1、菌株復(fù)蘇與純培養(yǎng)(核心)
從選擇性平板(MAC/XLD/ 顯色培養(yǎng)基)挑取典型可疑菌落,劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面。
36℃±1℃培養(yǎng)18~24 小時(shí),獲得新鮮、飽滿、均質(zhì)的菌苔(避免老化或污染)。
確認(rèn)純培養(yǎng):涂片革蘭染色為革蘭陰性短桿菌,無(wú)雜菌。
2、常規(guī)抗原制備
載玻片分區(qū):劃 2 個(gè) 1cm×2cm 區(qū)域,分別標(biāo)記“血清”與“生理鹽水”。
制備菌懸液:用接種環(huán)取一滿環(huán)新鮮菌苔,分別加入兩個(gè)區(qū)域,研磨成均勻乳狀液。
加試劑:“血清區(qū)”加 1 滴志賀氏菌診斷血清(多價(jià)優(yōu)先);“生理鹽水區(qū)”加 1 滴無(wú)菌生理鹽水作自凝對(duì)照。
觀察:輕搖玻片,1 分鐘內(nèi)于黑色背景觀察。
陽(yáng)性:血清區(qū)凝集成顆粒,生理鹽水區(qū)無(wú)自凝(均勻混濁)。
陰性:血清區(qū)不凝集,或生理鹽水區(qū)自凝(需換菌落重試)。
3、特殊情況:去除 K 抗原(避免假陰性)
若菌株不凝集或懷疑 K 抗原遮蔽,按以下步驟處理:
挑取菌苔至 1mL 無(wú)菌生理鹽水,制備濃菌液(充分混勻)。
100℃沸水浴15~60 分鐘(滅活并破壞 K 抗原層)。
冷卻后離心(3000r/min,10 分鐘)取上清菌泥,重懸后重復(fù)步驟 2 的常規(guī)凝集試驗(yàn)。
判讀:加熱后凝集陽(yáng)性,確認(rèn)存在 K 抗原遮蔽。
4、宋內(nèi)氏志賀氏菌(D 群)特殊說(shuō)明
無(wú) K 抗原,光滑型(S)凝集性好,粗糙型(R)不一定自凝,直接用常規(guī)方法即可。
先做 D 群血清試驗(yàn),陽(yáng)性再做 Ⅰ/Ⅱ 相分型。
四、關(guān)鍵質(zhì)控與注意事項(xiàng)
項(xiàng)目 要求 常見(jiàn)錯(cuò)誤與規(guī)避
培養(yǎng)物狀態(tài) 新鮮純培養(yǎng),18~24 小時(shí)斜面菌苔 避免使用陳舊培養(yǎng)(抗原降解)或污染菌落
自凝控制 生理鹽水對(duì)照必須無(wú)自凝 自凝則不可判讀,需換其他菌落重試
血清質(zhì)量 2~8℃避光保存,效價(jià)達(dá)標(biāo)(多價(jià)≥1:160,宋內(nèi)氏≥1:640) 嚴(yán)禁冷凍;臨用前恢復(fù)室溫
操作規(guī)范 全程無(wú)菌,避免交叉污染 接種環(huán)/針火焰滅菌,載玻片潔凈
判讀時(shí)效 1 分鐘內(nèi)觀察凝集反應(yīng) 反應(yīng)遲緩可置濕盒 20 分鐘再判
五、流程總結(jié)(快速參考)
挑可疑菌落→營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面 36℃培養(yǎng) 18~24 小時(shí)
制備生理鹽水菌懸液→加血清/生理鹽水對(duì)照
1 分鐘內(nèi)觀察:血清凝集 + 生理鹽水無(wú)自凝 = 陽(yáng)性
不凝集/可疑:100℃加熱 15~60 分鐘去 K 抗原后重試
陽(yáng)性后用多價(jià)→群→型血清逐步分群分型
六、常見(jiàn)問(wèn)題排查
假陰性:培養(yǎng)物老化、K 抗原遮蔽、血清失效/錯(cuò)配→換新鮮培養(yǎng)物、加熱去 K 抗原、核對(duì)血清效價(jià)與群別。
假陽(yáng)性:雜菌污染、血清交叉反應(yīng)→嚴(yán)格純培養(yǎng)、用多價(jià)血清初篩、設(shè)置生理鹽水對(duì)照。
自凝:菌株粗糙型變異、培養(yǎng)過(guò)度→挑光滑型菌落、新鮮培養(yǎng)、縮短培養(yǎng)時(shí)間。
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