一、儀器核心特點（蛋白質(zhì)測試優(yōu)勢）

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• 超高分辨：最高 240,000 FWHM@m/z200，<1 ppm 質(zhì)量精度，能區(qū)分質(zhì)量極近的肽段 / 修飾，減少假陽性。

• 高靈敏度 + 高速采集：AQT 四極桿提升離子傳輸，MS/MS 可達 20 Hz，適配 DDA/DIA/PRM 定量。

• 雙模式兼容：支持 Bottom?up（肽段） 與 Top?down（完整蛋白），適配蛋白鑒定、修飾分析、抗體 / 融合蛋白分子量測定。

二、樣品送樣硬性要求（與 HF?X 基本一致，更嚴）

1. 樣品量

• 蛋白溶液：≥50 μg（1 μg/μL，50 μL）

• 細胞：≥1×10?；組織：≥5 mg；血清：≥5 μL

2. 純度與雜質(zhì)（紅線：去垢劑 / 高聚物絕對禁止）

• ? 嚴禁：SDS、Tween、NP?40、PEG、甘油、高濃度尿素（>2 M）、鹽酸胍、Tris（>50 mM）、磷酸鹽、DTT（>1 mM）、β?ME（抑制電離、污染離子源 / 色譜柱）。

• ? 要求：

• 溶液酶解：純度 > 80%，無核酸 / 多糖 / 脂質(zhì)沉淀。

• 膠內(nèi)酶解：SDS?PAGE 考染單一條帶、無雜帶。

• 低電導：鹽濃度 **<10 mM**，避免峰畸變。

  
  

3. 酶解質(zhì)量（Bottom?up 關(guān)鍵）

• 酶：測序級胰蛋白酶（1:20–1:50，w/w），37℃，12–16 h；或 LysC?胰酶雙酶解（漏切率 < 10%，提升鑒定數(shù)）Thermo Fisher Scientific。

• 肽段長度：7–20 aa，濃度 0.1–1 μg/μL，體積 5–20 μL。

• 脫鹽：C18 柱脫鹽，去除未酶解蛋白、鹽、色素。

• 溶劑：0.1% 甲酸水（或 5% 乙腈 + 0.1% 甲酸），避免純有機溶劑。

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4. Top?down（完整蛋白）額外條件

• 分子量：<150 kDa（抗體可放寬）。

• 緩沖液：20–50 mM 乙酸銨（pH 6.5–7.5），無鹽 / 去垢劑 / 還原劑。

• 濃度：5–20 μM，體積 10–50 μL。

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5. 穩(wěn)定性

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• 新鮮制備：24 h 內(nèi)上機；短期 4℃ 避光；長期 ?80℃ 分裝（避免反復凍融），溶液澄清無沉淀。

三、標準實驗流程（Bottom?up，）

蛋白提取 → 定量（BCA）→ 取 50–100 μg。

還原（5 mM DTT，56℃，30 min）→ 烷基化（15 mM IAA，避光，室溫，30 min）。

胰酶酶解（37℃，16 h）→ 終止（1% 甲酸）。

C18 脫鹽 → 凍干 → 0.1% 甲酸復溶（0.5 μg/μL）。

Nano?LC?MS/MS 上機（EASY?nLC 1000 + Q Exactive HF）。

四、推薦質(zhì)譜參數(shù)模板（DDA，蛋白組鑒定）

• 全掃描（MS1）：70,000 FWHM@m/z200；m/z 350–1800；AGC 3e6；Max IT 20 ms。

• 碎片掃描（MS2）：17,500 FWHM；HCD 碰撞能量 27%；Top N 20；AGC 1e5；Max IT 50 ms；動態(tài)排除 15 。

• 色譜：預柱 Acclaim PepMap 100（2 cm×75 μm，C18，3 μm）；分析柱 EASY?Spray（15 cm×75 μm，C18，2 μm）；梯度 5%–30% B（乙腈 + 0.1% 甲酸），90 min，流速 300 nL/min。

五、常見拒收 / 問題與對策

• 峰抑制 / 無信號：含去垢劑或高鹽 → 重新脫鹽 / 換無去垢劑提取方案。

• 鑒定數(shù)低：酶解不（漏切率 > 20%）→ 雙酶解、延長酶解時間、降低蛋白量。

• 色譜柱堵塞：樣品渾濁 / 有沉淀 → 離心取上清、C18 脫鹽更。

• 質(zhì)量偏差大：鹽殘留 → 強化脫鹽、用揮發(fā)性緩沖液（甲酸 / 乙酸銨）。

六、HF 與 HF?X 關(guān)鍵差異（送樣無需調(diào)整，儀器端優(yōu)化）

• HF：最高 240,000 分辨率，MS/MS 20 Hz，常規(guī) DDA/DIA 夠用。

• HF?X：更高場軌道阱，MS/MS 40 Hz，掃描更快、定量更穩(wěn)，適合大樣本隊列 / 高深度 DIA。

七、快速自檢清單（送樣前必查）

無 SDS/Tween/PEG/ 甘油 → ?

鹽濃度 <10 mM、無高濃度尿素 / DTT → ?

蛋白總量 ≥50 μg、純度 >80% → ?

酶解后肽段 7–20 aa、漏切率 <10% → ?

溶劑為 0.1% 甲酸水、澄清無沉淀 → ?