背景介紹

● DBCO：二苯并環(huán)辛炔（無銅點擊化學核心基團）

● carboxyrhodamine 110：羧基羅丹明 110（熒光染料，綠色熒光）

● DBCO-carboxyrhodamine 110：DBCO 修飾羧基羅丹明 110 熒光探針

● 疊氮細胞： Ac?ManNAz 代謝標記疊氮細胞

● 工作原理：無銅點擊化學反應（SPAAC），DBCO 與疊氮（-N?）自發(fā)共價結合，實現(xiàn)細胞熒光標記

一、反應原理

• 染料：Carboxyrhodamine 110（CR110）綠色熒光

• 激發(fā)波長：~495 nm

• 發(fā)射波長：~520 nm

• 全程無需銅離子、無需催化劑，細胞毒性極低

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二、實驗前準備

•待標記細胞：Ac4ManNAz 預處理過的疊氮細胞（實驗組）

•陰性對照：不加 Ac4ManNAz 的普通細胞

•試劑

• -DBCO-Carboxyrhodamine 110 粉末

• -DMSO（母液溶劑）

• -PBS 緩沖液

• -基礎培養(yǎng)基（無血清培養(yǎng)基最佳）

• 4-% 多聚甲醛（固定用，可選）

  •母液配制

• -配制 10 mM DBCO-CR110 母液：粉末溶于無水 DMSO

• -分裝避光 -20℃保存，避免反復凍融

• -工作終濃度：1 μM（細胞標記通用初始測試濃度）

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ClickChemistrytools DBCO - 羧基羅丹明110 記疊氮修飾細胞的實驗方法

三、完整操作步驟（活細胞標記?流式細胞術專用）

1.收集細胞

貼壁細胞胰酶消化 / 懸浮細胞直接收集，1200 rpm，5 min 離心棄上清。

2.PBS 洗滌 1 次，重懸細胞。

3.稀釋探針

用無血清基礎培養(yǎng)基稀釋 10 mM 母液至工作濃度 1 μM。

禁止用含疊氮鈉 NaN?的 PBS / 培養(yǎng)基，會競爭性封閉反應！

4.孵育標記

細胞重懸于含 DBCO-CR110 的無血清培養(yǎng)基中，

室溫避光孵育 30 min。

5.充分洗滌

孵育結束，PBS 洗滌 2~3 次，每次 1200 rpm 5 min，洗去未結合游離染料。

6.檢測

重懸于 PBS，直接上機流式細胞儀綠色通道檢測。

四、免疫熒光爬片細胞標記步驟（共聚焦顯微鏡用）

1.細胞爬片經(jīng) Ac4ManNAz 代謝培養(yǎng)后，吸棄培養(yǎng)基。

2.PBS 輕柔清洗爬片 1 次。

3.加入含 1 μM DBCO-CR110 的無血清培養(yǎng)基。

4.室溫避光孵育 30 min。

5.PBS 充分洗滌 3 次，洗去游離探針。

6.可選：4% 多聚甲醛室溫固定 15 min。

7.DAPI 染核，封片，共聚焦顯微鏡觀察。

五、必須設置的對照組（排除假陽性）

•空白對照：未加 Ac4ManNAz、未加探針的原始細胞

•染料本底對照：未用 Ac4ManNAz，僅加 DBCO-CR110 孵育洗滌

（驗證非特異性吸附）

•疊氮實驗組：Ac4ManNAz 細胞 + DBCO-CR110（陽性信號組）

六、關鍵注意事項（非常容易踩坑）

•絕對不能含疊氮鈉（NaN?）

培養(yǎng)基、PBS 里的抑菌疊氮鈉會大量競爭 DBCO，直接導致標記失敗、無信號。

•全程避光

CR110 熒光極易光淬滅，孵育、洗滌、檢測全程鋁箔包裹避光。

•血清影響小，但無血清孵育背景更低

血清蛋白輕微非特異吸附，無血清條件信噪比好。

•孵育時間不要過長

30 min 足夠反應；超過 1h 只會增加非特異性吸附，不增強信號。

•DMSO 終濃度＜0.1%，避免細胞毒性。

•該標記在細胞膜表面，不進入胞內(nèi)，對應唾液酸膜糖蛋白定位。