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熒光探針法PCR試劑盒的操作方法
熒光探針法PCR試劑盒利用吸附柱提取RNA作為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以引物為起點合成與RNA模板互補的cDNA鏈；然后在DNA聚合酶的作用下，經(jīng)高溫變性、低溫退火和中溫延伸的多次循環(huán)，使特異DNA片段的拷貝數(shù)放大數(shù)百萬倍。將擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行電泳、染色后，在紫外燈下，肉眼可見DNA片段的擴(kuò)增帶。
一、樣品制備
樣品采集：：病死或撲殺的禽，取肺、脾、腦等組織；待檢活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物，放于50%甘油生理鹽水中或用注射器取血5mL，2～8℃保存。(要求送檢病料新鮮，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。)
組織樣品的處理：稱取組織0.1g于研磨器中磨碎，再加1mL生理鹽水繼續(xù)磨至無塊狀物；然后將樣品轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取100µL上清于1.5mL滅菌離心管中。2樣品處理：
全血樣品的處理：待血凝后取100µL血清于1.5mL滅菌離心管中。
陽性對照的處理：取陽性對照100µL于1.5mL滅菌離心管中。
陰性對照的處理：取陰性對照100µL于1.5mL滅菌離心管中。
二、病毒RNA的提取
取已處理的樣品、陰性對照和陽性對照，分別加入450µL裂解液，充分顛倒混勻，室溫靜置3min。
加入275µL無水乙醇，輕輕混勻。
將混合液吸入吸附柱中(吸取液體時盡量不要吸到懸浮雜質(zhì)，以免離心時堵塞吸附柱)，10,000rpm離心1min，棄去收集管中液體，套回收集管。
向吸附柱中加入500µL洗滌液A，10,000rpm離心1min，棄去收集管中液體，套回收集管。
向吸附柱中加入500µL洗滌液B，10,000rpm離心1min，棄去收集管中液體，套回收集管。
空柱10,000rpm離心2min。
將吸附柱移入新的無RNA酶的1.5mL離心管中，在膜中央加入30µL洗脫液，室溫靜置2min，10,000rpm離心1min，獲得總RNA。
三、RT-PCR
反應(yīng)體系：分別取14µLRT-PCR反應(yīng)液A(用前混勻)、4µLRT-PCR反應(yīng)液B(用前混勻)和2µL模板RNA，混勻。
反應(yīng)程序：在PCR儀上運行以下程序：42℃45min，94℃3min；94℃30s、53℃30s、72℃30s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。
四、電泳
制膠：用50倍稀釋的TAE電泳緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠。
電泳：待膠凝固后，取5µLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物點樣于瓊脂糖凝膠孔中，以5V/cm的電壓于50倍稀釋的TAE電泳緩沖液中電泳。
染色：取50倍稀釋的TAE電泳緩沖液30mL，加入10µL染色液，混勻后將膠浸泡30min，于紫外燈下觀察結(jié)果。
【結(jié)果判斷】
陽性對照出現(xiàn)400bp擴(kuò)增帶，陰性對照無帶出現(xiàn)(引物帶除外)時，實驗結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)400bp擴(kuò)增帶為新城疫病毒陽性，否則為陰性。
【需用但未提供的材料】
組織研磨器、眼科剪、眼科鑷、一次性注射器、瓊脂糖、經(jīng)焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的滅菌1.5mL離心管和吸頭(10µL、200µL、1000µL)。
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