在免疫組織化學(xué)（IHC）實(shí)驗(yàn)中，科研人可能會(huì)把主要精力投入到抗體選擇、抗原修復(fù)和顯色系統(tǒng)優(yōu)化上，而忽略一個(gè)關(guān)鍵的操作步驟：固定。固定并不僅僅是“把組織泡起來(lái)”的簡(jiǎn)單操作，而是需要精心設(shè)計(jì)、嚴(yán)格把控的實(shí)驗(yàn)藝術(shù)。固定需要在分子層面“凍結(jié)”生命活動(dòng)的瞬間，保持細(xì)胞形態(tài)的完整性，并保留抗原的免疫反應(yīng)性。

蛋白質(zhì)的物理、化學(xué)性質(zhì)迥異，對(duì)應(yīng)的固定方法和固定液的反應(yīng)也不盡相同。

「IHC診斷室」第7期，將系統(tǒng)梳理IHC常用固定液配方及其配制步驟，為實(shí)驗(yàn)者提供一份可信賴的技術(shù)參考。

一、甲醛類固定液：經(jīng)典中的經(jīng)典

10%中性緩沖福爾馬林（NBF）和4%多聚甲醛（PFA）依然是當(dāng)今IHC實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用廣泛的固定液。其固定機(jī)制在于與蛋白質(zhì)中的氨基、羥基等基團(tuán)形成交聯(lián)，穩(wěn)定組織結(jié)構(gòu)。

10%中性緩沖福爾馬林配制較簡(jiǎn)單，常規(guī)配方如下：

4%多聚甲醛（PFA）根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮褪褂脠?chǎng)景不同，有兩種配制方法。

溶液一的配制步驟：

(1) 稱取40 g多聚甲醛粉末，置于三角燒瓶中。

(2) 加入500-800 mL 0.1 M磷酸緩沖液（PB）。

(3) 加熱至60℃左右，持續(xù)攪拌（或磁力攪拌）使粉末溶解，通常需滴加少許1N NaOH才能使溶液清亮。

(4) 補(bǔ)足0.1 M磷酸緩沖液至1000 mL，充分混勻。

此固定液較適用于IHC研究，特別是動(dòng)物灌注固定取材及后續(xù)的浸泡固定（2-24 h）。固定液較為溫和，適合組織標(biāo)本的長(zhǎng)期保存。

溶液二的配制步驟：

(1) A液在500 mL的三角燒瓶中配制，加熱至60℃左右溶解。至多聚甲醛溶解后冷卻備用。

(2) 配制B液和C液。

(3) 將B液倒入C液中，混合后再加入A液。

(4) 用1N NaOH或HCl將pH值調(diào)至7.2-7.4。

(5) 加ddH₂O定容至1000 mL，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>

此固定液適用于光鏡和電鏡免疫組織或細(xì)胞化學(xué)研究。用于免疫電鏡檢測(cè)時(shí)，建議加入少量新鮮配制的戊二醛（終濃度為0.5-1%）。戊二醛屬于雙醛類固定劑，交聯(lián)能力比甲醛強(qiáng)，有利于保存超微結(jié)構(gòu)，但對(duì)抗原性的損傷也較大。在IHC實(shí)驗(yàn)中，戊二醛與甲醛聯(lián)合使用，能夠滿足結(jié)構(gòu)保存和抗原保留平衡的需求。

二、傳統(tǒng)固定液的改良與創(chuàng)新

2.1 Bouin's液及其改良配方

Bouin's液是組織學(xué)和病理學(xué)的傳統(tǒng)固定劑，由bitter acids、甲醛和冰醋酸組成。bitter acids沉淀蛋白引起組織收縮，但不會(huì)使組織硬化。Bouin's液對(duì)組織穿透力較強(qiáng)，固定效果好，對(duì)細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)顯示清晰，適用于富含結(jié)締組織、胚胎及植物組織的標(biāo)本，尤其在Masson三色法中，經(jīng)其固定后組織著色鮮艷。

Bouin's液常規(guī)配方為飽和bitter acids750 mL、40%甲醛250 mL、冰醋酸50 mL，混合后移至棕色瓶中，存于4℃冰箱。冰醋酸臨用前加入。改良版Bouin's液不加冰醋酸。

Bouin's液常規(guī)固定時(shí)間為12-24小時(shí)。由于該固定液呈酸性（pH 3-3.5），對(duì)抗原可能有一定損害，在固定1-2天后需換入4%的甲醛溶液中保存。

目前常用市售飽和bitter acids溶液直接配制。如果你手上是bitter acids粉末，則需要一種“邪修”方案了。首先在燒杯中加入1000 mL蒸餾水，并不斷加入bitter acids粉末，邊加邊攪拌，直至有少量bitter acids結(jié)晶出現(xiàn)為止。靜置并過(guò)濾。然后取750 mLbitter acids溶液與250 mL 40%甲醛混勻。最后加入冰醋酸。

2.2 Zamboni's液配方及其配制

Zamboni's固定液對(duì)超微結(jié)構(gòu)的保存效果好于甲醛，可用于電鏡和顯微鏡IHC檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)室常用配方為2.5%的多聚甲醛和30%的飽和bitter acids，固定時(shí)間控制在6-18小時(shí)。

2.3 PFG固定液的配制

PFG固定液由對(duì)苯醌、多聚甲醛和戊二醛構(gòu)成，結(jié)合了甲醛快速滲透和戊二醛的強(qiáng)效蛋白交聯(lián)能力，又不影響超微結(jié)構(gòu)的保存，適用于電鏡樣本的制備或?qū)Y(jié)果穩(wěn)定性要求高的IHC實(shí)驗(yàn)。

2.4 Karnovsky's固定液配制

適用于電鏡免疫化學(xué)檢測(cè)，在4℃短時(shí)固定效果好。推薦的操作流程為：進(jìn)行灌注固定，隨后浸泡固定10-30分鐘。“短時(shí)冷固定”策略已成為保存超微結(jié)構(gòu)和肽類抗原的常用方法。

讀到這里，你是否發(fā)現(xiàn)IHC固定液的世界遠(yuǎn)比“倒點(diǎn)甲醛泡一泡”要精彩的多，甲醛的“好搭子”遠(yuǎn)超想象。不同的組合、不同的配比，將會(huì)在組織或細(xì)胞結(jié)構(gòu)中呈現(xiàn)不一樣的結(jié)果。掌握這些固定液的配制方法，將會(huì)獲得一張?zhí)禺愋詮?qiáng)、背景干凈的精美片子。