頂空-GC-MS/MS法測定動物類中藥中三甲胺含量

本文利用三重四極桿氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀結(jié)合頂空進樣以及揮發(fā)胺專用柱SH-Volatil Amin，建立了動物類中藥中三甲胺的含量測定方法。

在0.1~10μg/mL濃度范圍內(nèi)三甲胺標準曲線線性關(guān)系良好, 線性相關(guān)系數(shù)0.9999。0.1μg/mL標準溶液連續(xù)進樣6針，峰面積RSD為6.40%。加標回收實驗中，加標濃度為50和500mg/kg，平均加標回收率為98.43%和95.64%，對應(yīng)RSD分別為9.10%和 2.06%。此方法可為動物類中藥中三甲胺定量分析提供參考，同時也為動物類中藥中腥臭氣味來源研究提供思路。

技術(shù)特點

1、創(chuàng)新性樣品制備方法，有效消除三甲胺易揮發(fā)性對實驗結(jié)果準確度的影響。

2、頂空進樣結(jié)合GC-MS/MS測定，有效抑制了基質(zhì)化學干擾，保證結(jié)果可靠性。

3、堿改性SH-Volatil Amin有效提升了對三甲胺的惰性，改善峰形及分析穩(wěn)定性。

三甲胺(Trimethylamine, TMA)是一種帶腥臭氣味的揮發(fā)性有機物，廣泛存在于肉類和海鮮等動物源性食品中。其主要來源于動物體內(nèi)一種蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑氧化三甲胺(Trimethyamine Oxide, TMAO)的酶促反應(yīng)，是判斷動物源性食物新鮮度的重要指標。

動物類中藥源自動物全體、器官、組織或加工制品, 其主要成分為蛋白、多肽類, 在臨床應(yīng)用中療效確切。但藥物腥臭氣突出, 例如中醫(yī)臨床常用的地龍、水蛭、美洲大鐮、雞內(nèi)金等均有明顯腥臭氣。TMA已被證實是動物類中藥腥臭氣味的相同關(guān)鍵氣味物質(zhì)之一，患者服藥順應(yīng)性對藥物中三甲胺含量提出了要求，因此需要開發(fā)用于動物類中藥中三甲胺含量測定的方法。

目前食品中三甲胺含量測定方法較為成熟，并建立了國家標準 GB 5009.179-2016《食品安全國家標準 食品中三甲胺的測定》，但該檢測方法容易受到三甲胺易揮發(fā)性和高吸附性干擾，影響實驗結(jié)果穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

本文利用GC-MS/MS 結(jié)合頂空進樣以及揮發(fā)胺專用柱SH-Volatil Amin，采用獨特樣品制備方法，建立了動物類中藥中三甲胺含量測定方法，并測定了地龍、水蛭和美洲大鐮等實際樣品中三甲胺含量。該方法靈敏度高，結(jié)果可靠，重現(xiàn)性良好，可為動物類中藥中三甲胺檢測提供參考。

實驗部分

1.1 儀器

三重四極桿氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀

自動進樣器

1.2 分析條件

樣品前處理

結(jié)果與討論

3.1 三甲胺標準溶液譜圖

3.2 標準曲線和質(zhì)量色譜圖

使用5%三氯乙酸溶液配制三甲胺鹽酸鹽標準溶液系列, 濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0μg/mL(以三甲胺計)，精密量取各濃度標準溶液2mL分別置于預(yù)制好的頂空瓶石蠟層上部，壓蓋密封后，進 GC-MS/MS分析。以三甲胺濃度為橫坐標，三甲胺定量離子對峰面積為縱坐標作標準曲線，標準曲線如圖2 所示，線性相關(guān)系數(shù)如表2所示，三甲胺質(zhì)量色譜圖見圖3。

3.3 重復(fù)性實驗及檢出限

取三甲胺鹽酸鹽標準溶液(以三甲胺計，0.1μg/mL) 2mL置于預(yù)制好的頂空瓶石蠟層上部，平行制備樣品6份并連續(xù)進樣，用于考察三甲胺峰面積的重復(fù)性，測定結(jié)果見表3。以3倍信噪比(峰至峰)計算檢出限，三甲胺儀器檢出限見表2。

3.4 加標回收率

三甲胺是動物類中藥中內(nèi)源性化合物，同時由于三甲胺的易揮發(fā)性，在本實驗中，選擇三甲胺鹽酸鹽標準溶液進行加標回收實驗。美洲大鐮中加標濃度分別為50和500mg/kg，按照前ER每個加標濃度平行制備3份加標樣品，考察回收率和RSD。50mg/kg加標水平下，加標回收率分布在88.08%-103.63% 之間，RSD為 9.10%；500 mg/kg加標水平下，加標回收率分布在93.39%-97.08%之間，RSD為2.06%；詳細結(jié)果見表4。

3.5 實際樣品分析結(jié)果

選取產(chǎn)地不同的地龍、美洲大鐮和水蛭為樣品，按前述樣品處理流程進行樣品制備，并采用上述儀器條件測定，三甲胺檢測結(jié)果如表5所示。

結(jié)論

本方法采用三重四極桿氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀結(jié)合頂空進樣以及揮發(fā)胺專用柱SH-Volatil Amin，建立了動物類中藥中三甲胺含量測定方法，并測定3種動物類中藥樣品中三甲胺含量。在0.1~10 μg/mL濃度范圍內(nèi)，三甲胺標準曲線線性相關(guān)系數(shù)0.9999；根據(jù)0.1μg/mL三甲胺標樣數(shù)據(jù)，以3倍信噪比(峰至峰)計算儀器檢出限為0.63 μg/L；在重復(fù)性實驗中，濃度為0.1 μg/mL三甲胺標準溶液連續(xù)進樣6針，峰面積RSD為6.40%；在50mg/kg和500 mg/kg加標水平下，平均加標回收率為98.43%和95.64%。實驗結(jié)果表明：該方法采用GC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測模式結(jié)合獨特樣品前處理方式，靈敏度高，結(jié)果準確，重現(xiàn)性良好，能夠有效監(jiān)測動物類中藥中三甲胺含量。