——以枯草芽孢桿菌搖瓶培養(yǎng)為例

摘要：搖瓶培養(yǎng)是實(shí)驗(yàn)室微生物發(fā)酵工藝條件摸索的常用方法，恒溫?fù)u床作為核心設(shè)備，其溫控精度、振蕩穩(wěn)定性及空間利用率直接影響實(shí)驗(yàn)效率與數(shù)據(jù)質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)以枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）為培養(yǎng)對象，使用HG-A220迷你恒溫?fù)u床進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，驗(yàn)證其在微生物培養(yǎng)中的溫控表現(xiàn)、振蕩穩(wěn)定性及操作便利性。結(jié)果表明，該設(shè)備溫度波動度在±0.2℃以內(nèi)，轉(zhuǎn)速精度±1 rpm，培養(yǎng)12 h后菌液OD???為2.46，滿足常規(guī)微生物培養(yǎng)要求。其可堆疊設(shè)計(jì)與緊湊外形有效拓展了實(shí)驗(yàn)室面積利用率，適合空間有限的實(shí)驗(yàn)室使用。

引言

恒溫?fù)u床集恒溫培養(yǎng)與振蕩混勻功能于一體，是微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、酶工程及發(fā)酵工程等領(lǐng)域的常用實(shí)驗(yàn)室設(shè)備。搖瓶培養(yǎng)通過液體培養(yǎng)基在三角瓶中振蕩，以滿足微生物生長、繁殖及代謝產(chǎn)物積累對溶氧的需求，是實(shí)驗(yàn)室放大工藝條件的常用方法?？莶菅挎邨U菌作為一種好氧微生物，其搖瓶培養(yǎng)過程對培養(yǎng)溫度、振蕩轉(zhuǎn)速及溶氧水平均有明確要求，是驗(yàn)證恒溫?fù)u床性能的合適模型。

傳統(tǒng)恒溫?fù)u床普遍存在占地面積大、功能單一、溫控精度不足等問題。近年來，各設(shè)備廠商陸續(xù)推出可堆疊結(jié)構(gòu)的小型化搖床，通過多層疊加拓展單位面積的通量，同時(shí)引入全溫段控制（加熱/制冷）和可編程操作系統(tǒng)，以適配更復(fù)雜的培養(yǎng)場景。本實(shí)驗(yàn)以HG-A220迷你恒溫?fù)u床為測試平臺，該設(shè)備具有以下特點(diǎn)：①可選1~2層可堆疊結(jié)構(gòu)，單層高度＜80 cm，可置于桌面或桌下使用；②配備加熱/制冷雙功能，全溫段覆蓋；③采用無刷電機(jī)，轉(zhuǎn)速精度＜1 rpm；④7寸彩色觸摸屏，支持50段編程控制；⑤標(biāo)配開門即停、超溫報(bào)警等安全功能。

本實(shí)驗(yàn)以枯草芽孢桿菌的搖瓶培養(yǎng)為載體，評估該設(shè)備的溫控精度、振蕩穩(wěn)定性、操作便利性及空間適配能力，為實(shí)驗(yàn)室設(shè)備選型提供參考。

實(shí)驗(yàn)部分

1、實(shí)驗(yàn)材料

菌種：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）斜面保藏菌種。

培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L，pH 7.0），121℃高壓滅菌20 min。

主要設(shè)備：

1)       迷你恒溫?fù)u床（HG-A220型，可加熱/制冷，上海赫田）

2)       超凈工作臺

3)       紫外可見分光光度計(jì)

4)       無菌移液管、250 mL三角瓶、試管等

2、實(shí)驗(yàn)方法

搖瓶種子液制備：從試管斜面菌種挑取1環(huán)菌苔，接種至含50 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，置于恒溫?fù)u床中37℃、180 rpm振蕩培養(yǎng)12 h，作為種子液。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：將上述種子液以2%接種量（v/v）轉(zhuǎn)接至含50 mL新鮮LB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，共制備6瓶。將三角瓶對稱放置于搖床托盤上，設(shè)定培養(yǎng)溫度37℃，振蕩頻率180 rpm，振幅26 mm，連續(xù)培養(yǎng)。

取樣與檢測：分別于培養(yǎng)0 h、4 h、8 h、12 h取樣，測定菌液OD???值（以空白LB培養(yǎng)基調(diào)零），同時(shí)觀察菌液渾濁度及沉淀情況。

溫度均勻性驗(yàn)證：在搖床內(nèi)腔四個(gè)角落及中心位置各放置一支校準(zhǔn)后的溫度計(jì)（精度0.1℃），設(shè)定溫度為37℃，運(yùn)行2 h后記錄各點(diǎn)溫度，計(jì)算溫度均勻性。

3、設(shè)備操作要點(diǎn)

1)       裝樣平衡：將三角瓶對稱放置于托盤上，使負(fù)載平衡，以減少運(yùn)行時(shí)的振動和噪音。

2)       參數(shù)設(shè)定：通過7寸彩色觸摸屏設(shè)置溫度37℃、轉(zhuǎn)速180 rpm、運(yùn)行時(shí)間12 h，開啟預(yù)約開機(jī)功能提前運(yùn)行。

3)       安全確認(rèn)：啟動前確認(rèn)門鎖閉合，運(yùn)行中若打開箱門，設(shè)備自動執(zhí)行“開門緩?fù)?功能，避免操作風(fēng)險(xiǎn)。

結(jié)果與分析

1、溫控性能

設(shè)定溫度37℃，設(shè)備運(yùn)行2 h后，內(nèi)腔各測溫點(diǎn)數(shù)據(jù)如下：

溫度波動度：±0.2℃以內(nèi)；溫度均勻性：≤0.5℃。

該溫控精度滿足枯草芽孢桿菌等大多數(shù)微生物的培養(yǎng)要求。設(shè)備配備的PID溫控系統(tǒng)在達(dá)到設(shè)定溫度后無明顯過沖，全溫段覆蓋（室溫-15~60℃）使其亦可用于低溫誘導(dǎo)表達(dá)或高溫條件下的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

2、振蕩穩(wěn)定性

設(shè)備以180 rpm連續(xù)運(yùn)行12 h，運(yùn)行過程中聲音平穩(wěn)，無明顯機(jī)械共振。采用的無刷電機(jī)配合多維傳動組合，轉(zhuǎn)速精度在±1 rpm以內(nèi)。酵母菌培養(yǎng)的研究表明，較高轉(zhuǎn)速可提高培養(yǎng)液中的溶解氧，促進(jìn)好氧微生物生長；本實(shí)驗(yàn)中180 rpm的轉(zhuǎn)速保證了培養(yǎng)液在250 mL三角瓶中形成良好對流，瓶壁未見菌體附著或沉淀堆積。

3、枯草芽孢桿菌生長曲線

各時(shí)間點(diǎn)OD???測定結(jié)果如下：

培養(yǎng)12 h后，菌液OD???為2.46，菌體生長旺盛，說明搖床的溫控條件與振蕩條件能夠支持枯草芽孢桿菌的好氧發(fā)酵過程。

4、空間利用率評估

設(shè)備單層外形尺寸為560×610×760 mm，高度小于80 cm，可放置于實(shí)驗(yàn)室桌面或?qū)嶒?yàn)臺下方。雙層疊加后整體高度約1500 mm，占地面積不變（約0.34 m2），培養(yǎng)通量

討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HG-A220迷你恒溫?fù)u床在溫控精度、振蕩穩(wěn)定性和操作智能化方面均能滿足常規(guī)微生物搖瓶培養(yǎng)的要求。以下幾點(diǎn)在實(shí)際使用中值得關(guān)注：

可堆疊結(jié)構(gòu)的實(shí)用價(jià)值：雙層獨(dú)立控溫設(shè)計(jì)允許上下層設(shè)置不同溫度進(jìn)行并行實(shí)驗(yàn)。例如，上層可在37℃下進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，下層可在25℃下進(jìn)行酵母培養(yǎng)，互不干擾。這對需同時(shí)開展多組溫度梯度實(shí)驗(yàn)的研究者尤為有用。

托盤的多功能性：內(nèi)腔標(biāo)配兩種托盤——可搖晃振蕩的彈簧網(wǎng)格托盤和可靜置培養(yǎng)的托盤，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求切換。彈簧網(wǎng)格托盤可適配250 mL、500 mL、1000 mL等多種規(guī)格的培養(yǎng)瓶，通用性較好。

智能控制的便利性：7寸觸摸屏支持50段程序編輯，可設(shè)置預(yù)約開機(jī)和定時(shí)關(guān)機(jī)，便于安排實(shí)驗(yàn)周期。屏鎖與多級密碼權(quán)限管理功能可防止誤操作，對多用戶共享設(shè)備的實(shí)驗(yàn)室較為實(shí)用。

結(jié)論

本研究以枯草芽孢桿菌搖瓶培養(yǎng)為模型，驗(yàn)證了HG-A220迷你恒溫?fù)u床在微生物培養(yǎng)中的應(yīng)用性能。主要結(jié)論如下：

1)       溫控性能優(yōu)良：溫度波動度≤±0.2℃，溫度均勻性≤0.5℃，全溫段覆蓋（室溫-15~60℃），可同時(shí)滿足加熱培養(yǎng)與低溫誘導(dǎo)需求。

2)       振蕩穩(wěn)定：無刷電機(jī)驅(qū)動，轉(zhuǎn)速精度＜1 rpm，連續(xù)運(yùn)行12 h無異常噪音或共振，多維傳動組合在長期使用中磨損較小。

3)       空間利用率高：可堆疊設(shè)計(jì)使單層高度＜80 cm，可放置于桌面或桌下；雙層疊加后占地面積不變，通量翻倍，適合空間緊湊型實(shí)驗(yàn)室。

4)       操作智能安全：7寸彩色觸摸屏支持可編程控制（50段×99循環(huán)）、預(yù)約開關(guān)機(jī)，開門即停、超溫報(bào)警等功能。

上海赫田科學(xué)儀器有限公司長期從事高精度恒溫?fù)u床、真空干燥箱及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的研發(fā)與制造。HG-A220迷你恒溫?fù)u床支持加熱/制冷雙模式、可堆疊擴(kuò)展、可編程觸控，并可選配光照培養(yǎng)模塊（0~30000 LX）、CO?/O?氣體控制等擴(kuò)展功能，適配微生物培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)、藻類培養(yǎng)及種子發(fā)芽等多種實(shí)驗(yàn)場景。歡迎廣大科研工作者與企業(yè)客戶垂詢選購。