酶偶聯(lián)法的檢測波長選擇

FBA 催化果糖-1,6-二磷酸（FBP）裂解為磷酸二羥丙酮（DHAP）和 3-磷酸甘油醛（G3P）。常用的檢測方法是偶聯(lián) α-甘油磷酸脫氫酶（GDH），DHAP 在 NADH 存在下被還原為 α-甘油磷酸，同時(shí) NADH 氧化為 NAD?。在 340nm 處監(jiān)測 NADH 吸光度的下降速率，每消耗 1μmol NADH 對(duì)應(yīng) 1μmol FBP 裂解。消光系數(shù) 6.22 mM?1cm?1，比色杯光徑 1cm 時(shí)，ΔOD???/min × 總體積（ml）× 1000 /（6.22 × 酶液體積 × 蛋白濃度）得到比活力（U/mg）。推薦使用 37℃ 恒溫比色皿，反應(yīng)體系 1ml。

緩沖液離子強(qiáng)度與 pH 優(yōu)化

FBA 活性強(qiáng)烈依賴 K? 和 NH?? 等單價(jià)陽離子。反應(yīng)緩沖液含 50mM Tris-HCl（pH 7.5）、100mM KCl、10mM NH?Cl、1mM MgCl?、0.1mM EDTA。K? 濃度低于 20mM 時(shí)酶活性下降 60%；NH?? 濃度從 5mM 升至 10mM，活性提高 30%。最適 pH 因來源而異：動(dòng)物 FBA 為 pH 7.2-7.6，植物和微生物 FBA 為 pH 7.8-8.2。偏離最適 pH 0.5 個(gè)單位活性損失約 25%。用 HEPES 替代 Tris 可減少溫度對(duì) pH 的依賴，HEPES 在 25-37℃ 范圍內(nèi) pH 變化僅 0.05 單位。

底物濃度與線性范圍

FBP 的 Km 值通常在 2-15μM 之間。推薦反應(yīng)底物濃度 1-2mM（約為 Km 的 100 倍）。低于 0.2mM 時(shí)反應(yīng)速率隨底物濃度線性下降，無法準(zhǔn)確測定 Vmax。偶聯(lián)酶 GDH 的加入量需超過 FBA 活性的 10 倍，否則 NADH 氧化速率受限于偶聯(lián)反應(yīng)而非 FBA。常用 GDH 終濃度 2U/ml。NADH 初始吸光度控制在 0.8-1.2 之間（對(duì)應(yīng)約 0.15-0.2mM NADH），反應(yīng)過程中 ΔOD 不應(yīng)超過 0.3，超出后 NADH 成為限制因素。

抑制劑與激活劑的驗(yàn)證參數(shù)

FBA 的特異性抑制劑包括焦磷酸（PPi，IC?? ≈ 0.5mM）和磷酸乙醇酸（PGA，IC?? ≈ 20μM）。驗(yàn)證抑制效果時(shí)，預(yù)先將酶與抑制劑在無底物條件下孵育 5-10 分鐘，再加入 FBP 啟動(dòng)反應(yīng)。激活劑方面，0.1mM 果糖-2,6-二磷酸（F2,6BP）可將植物胞質(zhì)型 FBA 的活性提高 3-5 倍，但對(duì)動(dòng)物型無影響。測定激活倍數(shù)時(shí)，加入 1μM F2,6BP 后連續(xù)監(jiān)測 5 分鐘，前 30 秒的初速率用于計(jì)算。

樣品制備的蛋白酶防護(hù)

FBA 對(duì)蛋白酶降解敏感。組織或細(xì)胞裂解液中加入 1mM PMSF（苯-甲-基-磺-酰-氟-）、2μg/ml 抑肽酶、1μg/ml 亮肽素。裂解使用 0.1% Triton X-100 或超聲破碎（功率 30W，10 秒脈沖，間隔 10 秒，共 6 次）。離心 15,000×g，4℃，15 分鐘，取上清立即測定。反復(fù)凍融兩次后酶活性下降超過 40%。樣品蛋白濃度測定用 Bradford 法，避免使用含 NH?? 的 Lowry 試劑，因?yàn)橥庠?NH?? 會(huì)干擾活性評(píng)價(jià)。

單位定義與質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

一個(gè)酶活性單位（U）定義為每分鐘催化生成 1μmol 產(chǎn)物所需的酶量。比活力以 U/mg 蛋白表示。陽性對(duì)照使用商品化兔肌 FBA（比活力 10-20 U/mg）。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照（不加 FBP）和試劑對(duì)照（不加酶液）。空白對(duì)照的 ΔOD??? 應(yīng)低于 0.005/min。批內(nèi) CV 值控制在 5% 以內(nèi)，批間 CV 值低于 10%。若陽性對(duì)照測定值低于說明書標(biāo)示值的 70%，檢查試劑保存條件和偶聯(lián)酶活性。