RNA 干擾（RNAi）是有效敲低基因表達以研究各種細胞類型中蛋白功能的最佳方法。在哺乳動物細胞的基因敲低過程中，傳統(tǒng)的 RNAi 方法需要使用合成的 RNA 二聚體（含有兩條未經(jīng)修飾的 21 聚體寡核苷酸），經(jīng)退火形成的短小干擾 RNA (siRNA)。Invitrogen™ Ambion™?Silencer™ Select siRNA?和?Stealth RNAi™ siRNA?利用化學修飾技術改進了上述傳統(tǒng)二聚體，以確保更好的 RNAi?結(jié)果。 

賽默飛提供siRNA產(chǎn)品，請訪問獲取產(chǎn)品信息。 

Silencer siRNA 

預設計的 Invitrogen?Silencer siRNA 適用于 RefSeq 數(shù)據(jù)庫中所有人類、小鼠和大鼠基因靶標。這些 siRNA 是利用高效且經(jīng)廣泛測試的算法設計得到，專門用于實現(xiàn)效力和特異性的基因沉默。每種 siRNA 均按照最高質(zhì)量標準進行合成并且提供完整的序列信息。 

此外，當您購買針對相同靶點的三種 Silencer 預設計 siRNA 時，我們保證至少兩個 siRNA 會將靶標 mRNA 水平降低 >70%。 

優(yōu)化設計 = 保證沉默 

Silencer 預設計和驗證 siRNA 通過專有算法設計，專門用于實現(xiàn)效力和特異性。在近400種內(nèi)源表達的人轉(zhuǎn)錄本沉默實驗中，我們測得約1,100種經(jīng)該算法設計的 siRNA的效率。此研究表明，對于每個 siRNA，超過 80% 的 siRNA 個體表現(xiàn)出 >>70% 的靶標沉默效果。性能數(shù)據(jù)清楚地證實了 Ambion siRNA 選擇過程的成功。 

Silencer 預設計 siRNA 的有效性。此圖顯示了針對靶向 >300 種內(nèi)源表達的人基因的808種 Silencer 預設計 siRNA 測得的基因沉默效果分布情況。靶標 mRNA 水平在轉(zhuǎn)染成 HeLa 細胞后48小時通過 qRT-PCR 測定。超過 82% 的 siRNA 均成功沉默 >70% 的靶標。 

經(jīng)驗證的 Silencer siRNA 

針對人靶標的一組 Silencer siRNA 系列已經(jīng)通過內(nèi)部的功能測試，經(jīng)驗證，可以將靶標 mRNA 水平至少減少 70%，使我們能夠保證這些 Silencer 經(jīng)驗證 siRNA 能夠敲低其靶標基因。這些 siRNA 的數(shù)據(jù)表展示了在測試期間觀察到的 mRNA 敲低程度以及 siRNA 靶向的外顯子。對于大多數(shù)類型，還免費提供完整的序列信息。 

我們在先進機構中合成和純化各 siRNA 以便滿足最高質(zhì)量標準。作為我們嚴格的質(zhì)量控制程序的一部分，每個 RNA 寡核苷酸均由 MALDI-TOF 質(zhì)譜和/或分析型 HPLC 分析。為了提供質(zhì)量，Ambion 還通過凝膠電泳評估每個退火的 siRNA，以確認該鏈正確退火。因此是被純化并可以直接使用的優(yōu)質(zhì) siRNA 。 

Stealth RNAi siRNA 

Invitrogen Stealth RNAi siRNA 采用下一代 RNAi 化學成分，其特異性以及血清和細胞培養(yǎng)穩(wěn)定性均高于標準 siRNA。這種化學成分在消除不必要的脫靶效應的同時產(chǎn)生更清晰的結(jié)果，實現(xiàn)： 

· 有效敲低 

· 更高特異性 

· 更好穩(wěn)定性 

· 更低細胞毒性 

Stealth RNAi siRNA 采用極嚴格的質(zhì)量控制標準制造。每個單鏈 RNA 寡核苷酸均通過質(zhì)譜分析，然后退火并提供指定數(shù)量的雙鏈。 

Stealth siRNA 下一代化學成分的優(yōu)點 

有效敲低 

Stealth RNAi siRNA 提供有效敲低效率，以確保靶標基因的沉默。圖1顯示了 Stealth RNAi 和未修飾 siRNA 之間的沉默比較，Stealth RNAi 具有以下功能保證：倘若您實驗的轉(zhuǎn)染效率至少為 80%，對于每種基因，3種試劑中的至少2種將使夠?qū)崿F(xiàn)至少 70% 的轉(zhuǎn)錄物敲低。 

圖1.使用 Invitrogen Lipofectamine 2000 遞送的 siRNA 和 Stealth RNAi siRNA 可減少 A549 細胞中 p53 的表達。相應的對照包括化學成分匹配且堿基對成分類似的隨機序列。p53 表達的減少表現(xiàn)為標準化為 GAPDH 的 p53 的表達倍數(shù)變化（相對于實時熒光定量 PCR 測量的相應對照品）。 

更高的特異性 

當 siRNA 與非靶向基因足夠同源時，會發(fā)生脫靶效應，從而使其與預期靶標沉默。Stealth RNAi 可以消除使用傳統(tǒng) siRNA（即使是低濃度）導致的可能存在問題的正義鏈介導的脫靶效應。這些問題可能是由于未修飾 siRNA 的正義和反義鏈都能進入 RNAi 通路所引起。但 Stealth RNAi 修飾只允許反義鏈有效進入 RNAi 通路。這種修飾消除了對正義鏈脫靶效應的擔憂。 

圖2.?Stealth RNAi siRNA 表現(xiàn)出更高的靶標特異性。 

更好的穩(wěn)定性 

與傳統(tǒng)、未修飾的 siRNA 相比，Stealth RNAi 修飾還能提高穩(wěn)定性。傳統(tǒng) siRNA 在含核酸酶的血清中隨時間降解，因而它們不適合用于動物。 

但是，Stealth RNAi siRNA 可穩(wěn)定長達72小時（圖3），因而成為涉及使用動物模型的項目的更好選擇。這種靈活性可以節(jié)省數(shù)周時間，免卻了為動物研究和細胞培養(yǎng)工作開發(fā)和測試不同分子的需要。 

圖 3.?Stealth RNAi siRNA 在血清中比標準 siRNA 更穩(wěn)定。在 10% 小鼠血清中孵育后0、4、8、24、48、72小時的未修飾 21-mer dsRNA 序列（左圖）和相應的 Stealth RNAi siRNA 序列（右圖）。孵育樣品后，在 Invitrogen Novex 15% TBE-尿素聚丙烯酰胺預制凝膠上分離。 

更低細胞毒性 

使用標準 siRNA 的研究表明，未修飾 siRNA 可以誘導細胞應激反應通路，如可導致生長抑制和細胞毒性的干擾素反應。這使得很難評估觀察到的細胞表型是非特異性應激反應還是靶向基因的功能喪失所導致。Stealth RNAi 消除了 PKR/干擾素反應通路的誘導發(fā)生，確保 RNAi 實驗結(jié)果更清晰（圖4）。使用 Stealth RNAi 可實現(xiàn)*的基因敲低而無激活細胞應激反應的風險，細胞應激反應會導致結(jié)果難以解釋。 

圖4.?Stealth RNAi siRNA 避免干擾素反應基因的誘導。在送入 A549 細胞后，siRNA 序列誘導多種干擾素基因。siRNA 序列相同的 Stealth RNAi siRNA 型號不會改變干擾素反應基因的表達。 

處理和重懸 

siRNA 試劑的儲存和穩(wěn)定性： 

在 –20°C 以干燥顆粒形式儲存，直至使用。一旦重懸，請在 –20°C 下儲存并避免與 RNase 接觸。在 -20°C 下儲存至少一年。 

重懸 siRNA 

根據(jù)圖表在 DEPC 處理過的水中重懸 siRNA 或 Stealth RNAi 雙鏈，以制備 20 µM 溶液。將緩沖溶液脫水制備 RNA 寡核苷酸。重懸至 20 µM 會將緩沖液復溶為 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)、20 mM NaCl 和 1 mM EDTA。 

Stealth RNAi 和 siRNA 轉(zhuǎn)染濃度 

Stealth RNAi siRNA 或 siRNA 雙鏈的轉(zhuǎn)染濃度通過將所用摩爾量除以取決于最終轉(zhuǎn)染體積（即起始培養(yǎng)基體積加轉(zhuǎn)染混合物體積）確定。使用強效 siRNA 時，我們通常通過針對24孔板中的每個孔向 500 µL 培養(yǎng)基（最終濃度 0.8 - 8 nM）中加入 100 µL 轉(zhuǎn)染混合物來轉(zhuǎn)染 0.5 – 5 pmol。要按比例放大，請增加 siRNA 數(shù)量使其濃度不變。我們建議使用能夠敲低您基因的 siRNA 量，以避免任何非特異性或脫靶效應。 

Silencer Select siRNA 

· 集成了最新改良的siRNA設計、脫靶效應預測算法和化學修飾方法 

· 具有沉默一致性、效力和特異性 

· 由于沉默效果不佳而導致實驗失敗結(jié)果的次數(shù)大大減少 

· 生成更為清晰和穩(wěn)定的表型數(shù)據(jù) 

· 升級：siRNA實驗假陽性和假陰性結(jié)果大大減少 

Silencer Select siRNAs具有以下四大優(yōu)勢： 

· 高沉默效率?- 沉默可達其它siRNAs的100倍 

· 高特異性?- 鎖核酸修飾最多可減少90% 的脫靶效應 

· 高可信度?- 被廣泛證明的表型結(jié)果一致性 

· 高保障?- 100% 保證沉默效率，業(yè)內(nèi)最高保障 

使用 Silencer Select siRNA 進行靶向基因沉默 

Silencer Select 設計算法 

· 包含>90 種不同的序列和熱力學參數(shù) 

· 與上一代 siRNA 設計算法相比，預測準確性提高 28% 

· 給出的 siRNAs 沉默效率比其他供應商的修飾和未修飾 siRNAs 高達100 倍 

· 與其他 siRNA 相比，在靶編輯百分比顯著提高 

大多數(shù) siRNA 設計算法給出的siRNAs，僅能以約 80% 的置信度 預測70% 的靶向 mRNA 沉默效率，而無法給出更有效的 siRNAs。許多 RNAi 應用需要的沉默效率高于當前算法提供的效率。因此，我們使用*的機器學習方法和來自數(shù)千個 siRNA 的性能數(shù)據(jù)來更好地了解 siRNA 的序列、靶標位置和熱力學特性及其沉默效率之間的聯(lián)系。Silencer Select siRNA 設計算法油然而生。 

圖 1.Silencer Select siRNA 設計算法顯著提高了有效的 siRNA 預測準確度。?Silencer Select siRNA 設計算法用于針對 40 個不同的靶標設計 155 種 siRNAs。在 HeLa 細胞中使用這些 siRNAs 與舊版算法設計的siRNAs 進行平行測試。在轉(zhuǎn)染后 48 小時使用 TaqMan 基因表達檢測實驗通過 qRT-PCR 測量 mRNA 敲低效果。結(jié)果表示為 Silencer Negative Control #1 siRNA 處理的細胞的 mRNA 表達量的百分比。插圖顯示了≥70% 和≥80% mRNA 敲低效果的 siRNAs 的百分比。 

增強特異性以減少脫靶效應 

序列特異性脫靶效應是 RNAi 實驗中出現(xiàn)假陽性結(jié)果的主要原因之一。除了 Silencer Select 算法和生物信息學篩選標準提供的效力改進之外，Silencer Select siRNA 還結(jié)合了經(jīng)證實可提高 siRNA 特異性的修飾技術。 

Silencer Select siRNAs 中的化學修飾： 

· ?持續(xù)增強引導鏈 (反義鏈) 偏向性，這已被證明與沉默效率密切相關 

· 防止過客鏈 (正義鏈) 誘導沉默，這有助于減少脫靶效應 

o 與未修飾的 siRNA 相比，將基因表達陣列檢測到的非靶向、差異表達基因的數(shù)量減少多達 90% 

o 不會對沉默效率產(chǎn)生負面影響，因此不會影響預期的表型 

o 產(chǎn)生更清晰、更一致的細胞生物學數(shù)據(jù) 

圖 2.Silencer Select siRNA 修飾可減少脫靶效應并產(chǎn)生更可靠的表型數(shù)據(jù)。53 種不同的 siRNAs，包括以前指出會引發(fā)脫靶效應的舊設計，以 30 nM 的濃度將未修飾和 Silencer Select 修飾的 siRNAs 轉(zhuǎn)染到 U2OS 細胞中。48小時后測量有絲分裂和細胞凋亡。數(shù)據(jù)以陰性對照 siRNA 轉(zhuǎn)染細胞為對比展示。黑色 = 與對照相似的有絲分裂/凋亡水平。綠色 = 下調(diào)。紅色 = 上調(diào)。請注意，修飾未改變 PLK 和 WEE1 siRNAs 的預期有絲分裂和凋亡表型。相反，通過添加 Silencer Select 修飾消除了 10 個未修飾 siRNAs 介導的脫靶凋亡表型。 

圖 3.Silencer Select siRNA 修飾可減少差異表達的脫靶基因的數(shù)量。三個帶有和不帶有 Silencer Select 修飾的陰性對照 siRNA 分別以 30 nM 濃度轉(zhuǎn)染到 HeLa 細胞中。在 Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array 上提取和分析 RNA，共進行三次。y 軸表示差異表達基因的平均數(shù)量——與模擬轉(zhuǎn)染樣品相比，表達變化≥2 倍的基因。 

高保障的沉默效率 

100 % 保證 – 業(yè)內(nèi)最佳 

在 Thermo Fisher Scientific，我們保證當您購買兩個 Invitrogen Silencer Select 預先設計的針對同一靶標的 siRNA 時，這兩個 siRNAs 將使靶標 mRNA 沉默 70% 或更多。要獲得保證，siRNA 必須在 ≥5 nM 濃度下轉(zhuǎn)染，并且在轉(zhuǎn)染后 48 小時檢測 mRNA 水平。 

經(jīng)過 Silencer Select 驗證的 siRNA 

針對人類靶標的一部分 Invitrogen siRNAs 已在內(nèi)部進行了功能測試，并經(jīng)驗證可將靶標 mRNA 水平降低 70% 或更多，使我們能夠保證這些經(jīng)過 Silencer Select 驗證的 siRNAs 將沉默其靶標基因。這些 siRNA 的數(shù)據(jù)表展示了在測試期間觀察到的 mRNA 敲低程度以及 siRNA 靶向的外顯子。對于大多數(shù)類型，還免費提供完整的序列信息。 

免費獲取 Silencer Select siRNA 序列和相關數(shù)據(jù) 

近年來，siRNA 篩選突出了該技術的問題，這些問題源于脫靶效應、不穩(wěn)定的沉默效率以及篩選結(jié)果的低水平置信度。 

美國國立衛(wèi)生研究院的研究人員在《自然》雜志上發(fā)表的全基因組篩選文章強調(diào)了一種有效的方法來規(guī)避篩選研究目前面臨的挑戰(zhàn)。本文獻重點介紹了從種子區(qū)域產(chǎn)生的假陽性中篩選獲取真陽性的新生物信息學技術。種子序列驅(qū)動的脫靶效應已在 siRNA 篩選中廣泛觀察到，因為它們源于種子驅(qū)動的 mRNA 調(diào)節(jié)的內(nèi)源性 miRNA 機制。這項開創(chuàng)性的工作突出了作為單個排列的在較低 siRNA 濃度下使用高效 Silencer Select siRNA，從而可以識別源自種子序列的脫靶（假陽性或假陰性）。這種解卷積不能用于混合型 siRNA 篩選 (由于兩個或多個 siRNA 以協(xié)同方式工作，因此可以觀察到生物學特性)。 

國家科學轉(zhuǎn)化促進中心 (NCATS) 和 Thermo Fisher Scientific 為所有研究人員提供了從人類全基因組 Silencer Select siRNA 文庫中獲取 siRNA 序列和 PubChem 相關數(shù)據(jù)的途徑，該文庫包括針對 20,000 多個人類基因的 65,000 條 siRNA 序列。 

高質(zhì)量的 RNA 合成 

我們在經(jīng)過 ISO13485 和 ISO9001 認證的設施中合成和純化每條 siRNA，以滿足最高質(zhì)量標準。作為我們嚴格質(zhì)量控制程序的一部分，每個 RNA 寡核苷酸都通過 LCMS 和/或分析型 HPLC 進行分析。結(jié)果是被純化并可以直接使用的優(yōu)質(zhì) siRNA 。 

如需合作轉(zhuǎn)載本文，請文末留言。 

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