顯微穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜

熒光，是一種物質光致發(fā)光現(xiàn)象。物質產生熒光需要具備特定的結構和電子躍遷特性。通常，具有共軛雙鍵體系、剛性平面結構以及特定的官能團等特征的分子更容易產生熒光。從微觀角度分析，當物質分子受到光照射時，分子會在吸收光子能量時被激發(fā)，分子內的電子會從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，處于激發(fā)態(tài)的電子是不穩(wěn)定的，會在很短的時間內（通常在10??到10??秒之間）回到基態(tài)，同時以光的形式釋放出多余的能量，這種發(fā)射出的光就被稱為熒光。

圖1 熒光原理圖

熒光光譜在時域上分為穩(wěn)態(tài)和瞬態(tài)熒光光譜。穩(wěn)態(tài)熒光光譜主要研究物質在連續(xù)光源照射下的熒光信號，檢測熒光信號/強度(y)是波長(x)的函數(shù)。瞬態(tài)熒光光譜主要研究物質在脈沖光源照射后，熒光信號/強度隨時間的變化，一般檢測的熒光信號/強度(y)是時間(x)的函數(shù)。瞬態(tài)熒光光譜又稱熒光壽命曲線/時間分辨熒光光譜(TRPL),在瞬態(tài)熒光領域中，熒光壽命是對時間分辨熒光光譜的具體解釋，其定義為熒光物質在吸收光能量后被激發(fā)到激發(fā)態(tài)后，從激發(fā)態(tài)返回到基態(tài)并釋放熒光光子所需的平均時間。它是熒光現(xiàn)象的核心時間特性，反映了熒光分子與其周圍微環(huán)境的相互作用，具有重要的科學和應用價值。相較于穩(wěn)態(tài)熒光測量所獲取的、反映激發(fā)態(tài)粒子系綜平均行為的信號，熒光壽命測量則提供了激發(fā)態(tài)分子衰變動力學的直接信息。前者主要指示特定光物理過程或化學反應的發(fā)生，而后者通過解析激子態(tài)弛豫的速率常數(shù)，能夠深入揭示導致該過程發(fā)生的具體物理機制。

穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜應用

1.材料科學

在半導體材料的發(fā)光特性測量應用中通常用激光激發(fā)材料產生熒光，利用熒光光譜分析材料的光學特性，單層MoS?因直接帶隙特性熒光Z強，隨層數(shù)增加轉變?yōu)殚g接帶隙導致熒光驟減，即可從PL譜可判斷MOS2層數(shù)。（參考文獻：Krishna et al., Nanoscale, 2014, 6, 13028–13035；）

圖2 熒光光譜與成像對MOS2薄膜的定性分析

關于真空沉積CH?NH?PbI?（eMAPI）鈣鈦礦薄膜的研究中，穩(wěn)態(tài)熒光和瞬態(tài)熒光譜技術扮演了互補且關鍵的角色。共同揭示了真空沉積鈣鈦礦薄膜（eMAPI）中光物理特性與器件性能之間的內在聯(lián)系。圖3. (A)穩(wěn)態(tài)測量結果表明，基于eMAPI的太陽能電池實現(xiàn)了高達20.6%的轉換效率和1.16 V的開路電壓，證明了其優(yōu)異的體相質量，但這與常規(guī)認知中長熒光壽命是高效率前提的觀點相矛盾，因為eMAPI的熒光壽命極短。圖3. (B)瞬態(tài)熒光技術作為核心分析手段，解決了這一矛盾。實驗首先確認了eMAPI的超短熒光壽命（僅約0.75 ns），隨后通過表面鈍化實驗發(fā)現(xiàn)，鈍化后壽命顯著延長至73.5 ns，這確鑿地證明了其短壽命并非源于體相非輻射復合，而是由薄膜表面的快速非輻射復合所主導。

（參考文獻：Jubok et al., J. Phys. Chem. Lett. 2019,10,5167-5172）

圖3 非鈍化與鈍化情況下，eMAPI玻璃層的瞬態(tài)熒光

襯底作為二維材料緊密接觸的支撐結構，其鄰近摻雜效應可顯著調控二維材料的光學特性。研究人員利用熒光壽命成像顯微鏡技術，說明鄰近摻雜效應直接調控著MoS?中載流子的生成與復合動力學過程。具體而言，ITO襯底上的MoS?表現(xiàn)出顯著的載流子壽命和熒光壽命縮短。這是由于隨著載流子密度增加，材料中的缺陷捕獲電荷的可能性增加，被捕獲的載流子能保持更長的時間，減少它們對電荷傳輸?shù)呢暙I并增加復合的可能性，進而使載流子壽命縮短。穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光的檢測表征技術揭示了襯底對二維材料光電性質的調控機理，為未來設計和優(yōu)化高性能二維材料光電器件開辟了新途徑，具有重要的科學意義和應用前景。（參考文獻： Loc et al., Laser & Photonics Reviews.2025.e00682）

圖4 單層MoS2在不同襯底上的 (a) 熒光特性 (b) 熒光壽命成像實驗結果

2.生物醫(yī)學

熒光光譜對疾病的早期預防和診斷具有無損檢測的監(jiān)測優(yōu)勢。通過熒光光譜對宮頸癌病變前后的樣本進行檢測，其光譜的高靈敏度可反映細胞代謝異常，能發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)病理難以檢測的微小病變（參考文獻：Jeong et al., Journal of Biophotonics 2018;11(5):e201700245）

圖5. 一個癌前病變CINIII的患者，兩個不同部位的切片組織形態(tài)表現(xiàn)出差異，A為尚未病變，B為病變。C和D展現(xiàn)出一致的光譜特性

此外，瞬態(tài)熒光光譜及其熒光壽命成像對腫瘤細胞的的診斷也提供了依據(jù)，作為一種快速、靈敏且微創(chuàng)的輔助診斷手段通常會和內窺鏡等醫(yī)療器械共同作用，凸顯出穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜的應用潛力。

圖6. 肺癌患者腫瘤交界區(qū)域的熒光壽命顯微成像

3.藥代動力學

基于穩(wěn)態(tài)和瞬態(tài)熒光光譜，以高發(fā)光性的CA/EDA-CDs作為探針，對·OH具有選擇性的熒光響應。通過熒光檢測手段，實現(xiàn)了對氨茶堿（一種基于黃嘌呤的支氣管擴張劑）的監(jiān)測，CA/EDA-CDs 顯示出高量子產率（56.56%），且其發(fā)射峰在450 nm處保持穩(wěn)定，表明其具有激發(fā)獨立性及其作為探針的優(yōu)勢，使用瞬態(tài)熒光光譜儀記錄CA/EDA-CDs的壽命衰減，露于·OH后，引入破壞了共軛系統(tǒng)，平均熒光壽命從15.11 ns降至12.08 ns，表明·OH誘導了非輻射能量耗散。TCSPC則量化了這一過程對激發(fā)態(tài)動力學的動態(tài)影響。（參考文獻：Yif et al., Materials Today Bio 33:102019）

圖7. （A）探針及Fe-XOD酶催化系統(tǒng)檢測氨茶堿（AMP）的可行性分析。（B）電子順磁共振（ESR）。（C）紫外-可見吸收光譜。（D）CA/EDA-CDs的熒光發(fā)射過程示意圖及由Fe²?+XOD催化AMP產生的·OH引起的CA/EDA-CDs能帶結構變化及熒光猝滅機理。(E)CA/EDA-CDs, CA/EDA-CDs+AMP, CA/EDA-CDs+XOD, CA/EDA-CDs+Fe²?+XOD和CA/EDA-CDs+Fe²?+XOD+ AMP的熒光壽命衰減曲線。

4.熒光探針

瞬態(tài)與穩(wěn)態(tài)熒光光譜技術的結合應用為熒光探針的開發(fā)和優(yōu)化提供了多維度、深層次的分析手段。在該研究中，通過穩(wěn)態(tài)和瞬態(tài)熒光光譜技術研究了8-甲氧基-3-羧乙基香豆素（8EMOHCC）在不同溶劑中被苯胺猝滅的熒光行為。穩(wěn)態(tài)熒光測量如圖8.（B）所示，隨著苯胺濃度增加，8EMOHCC的熒光強度顯著降低，但光譜形狀和峰值未發(fā)生位移，表明無激基復合物形成。穩(wěn)態(tài)S-V曲線在所有溶劑中均呈線性，符合動態(tài)猝滅特征，且猝滅常數(shù)KSV隨溶劑介電常數(shù)增大呈非線性增加，表明溶劑極性通過調控電荷轉移過程影響猝滅效率。

瞬態(tài)熒光實驗如圖8.（C）所示，通過時間相關單光子計數(shù)技術記錄了熒光壽命衰減曲線，發(fā)現(xiàn)衰減呈單指數(shù)形式，證明猝滅過程均勻。瞬態(tài)S-V曲線同樣呈線性，進一步確認猝滅為動態(tài)主導。通過多溶劑體系下的穩(wěn)態(tài)與瞬態(tài)熒光聯(lián)用，明確了8EMOHCC的猝滅機制為擴散與激活協(xié)同的動態(tài)過程，并揭示了溶劑介電常數(shù)的關鍵作用。該方法與結論對熒光探針設計、生物分子相互作用研究及光物理機制探索具有重要參考價值。（參考文獻：Keerthana et al., J Fluoresc (2021) 31:393–400）

圖8. （A）8EMOHCC分子結構。（B）8EMOHCC在丙醇溶劑中不同濃度苯胺的典型熒光光譜。（C）8EMOHCC與不同濃度苯胺在丙醇溶劑中的熒光衰減光譜。

5.環(huán)境監(jiān)測

在復雜的環(huán)境基質中，多種污染物的共存對生態(tài)系統(tǒng)和公眾健康構成重大威脅，通過熒光特征峰可以快速且靈敏的對目標污染物進行篩選，通過使用賴氨酸銅納米團簇、半胱氨酸銅納米團簇和氨基酸銅納米團簇三種具有獨特配體結合親和力的銅納米團簇（Cu NCs），與機器學習算法結合，可以區(qū)分多種重金屬離子和農藥。（參考文獻：Varghese et al., Biosensors and Bioelectronics,2025,287(117706)）

圖9. 三種銅納米簇及其熒光激發(fā)光譜、發(fā)射光譜

6.食品安全

在食品科學中，熒光光譜技術作為一種快速、無損的分析工具，被系統(tǒng)應用于監(jiān)測食物中化學成分變化。如圖10所示，通過同步掃描和定點激發(fā)獲取了牛奶在酸化過程中不同時間點的光譜數(shù)據(jù)，通過光譜變化解析牛奶酸化過程中的化學成分變化，再建立熒光指標與酸度的線性模型，實現(xiàn)酸化程度的準確預測，為開發(fā)實時監(jiān)測設備提供理論基礎，助力乳品行業(yè)的質量控制與優(yōu)化。（參考文獻：Sudhakar et al., Agriculture 2023, 13, 1054）

圖10. 牛奶在光致發(fā)光激發(fā)下的熒光光譜特性

熒光光譜被用作核心分析手段，用于探究特級初榨橄欖油（EVOO）在激光誘導下的熒光特性及其摻假識別問題。研究采用405 nm連續(xù)波（CW）二極管激光作為激發(fā)光源，系統(tǒng)測量了EVOO及其摻假樣本（如摻入葵花籽油SO）在不同探測角度下的熒光光譜。通過分析熒光光譜的強度分布和譜形變化，研究者識別出EVOO中主要熒光團（如葉綠素衍生物、類胡蘿卜素和維生素E）的貢獻。（參考文獻：Duong et al., Microchemical Journal 214 (2025) 114023）

圖11. （A）摻假橄欖油（B）特級初榨橄欖油樣品在405 nm激光激發(fā)下的熒光光譜以及在不同檢測角度下檢測到的光譜及其分析