樣本量過(guò)少

增加起始樣本量。對(duì)于微量樣本，可加入糖原（20 mg/mL）或線性丙烯酰胺作為助沉劑。

樣本裂解/勻漿不徹-底

確保組織研磨成粉末狀，或細(xì)胞被充分吹打裂解。對(duì)于難裂解組織，可增加裂解液用量或延長(zhǎng)孵育時(shí)間。

沉淀時(shí)丟失

尤其注意微量RNA沉淀可能肉眼不可見(jiàn)。棄上清時(shí)務(wù)必小心，可保留少許上清。離心后標(biāo)記沉淀可能的位置。

RNA未完-全溶解

避免沉淀過(guò)度干燥。溶解時(shí)用移液器反復(fù)吹打，或在55-60°C孵育10分鐘（注意不要加熱過(guò)久）。

水相回收時(shí)未全部回收

在TRIzol法中，若擔(dān)心DNA污染而只取少量水相，會(huì)犧牲得率?？稍诩兌仍试S范圍內(nèi)，適當(dāng)多取一些。

蛋白質(zhì)污染

1. 在吸取水相時(shí)，混入了中間的蛋白質(zhì)相層。下次操作時(shí)更小心，留出更多安全距離。2. 對(duì)于富含蛋白的樣本，可增加氯仿抽提次數(shù)（TRIzol法）。

苯酚殘留

1. 確保吸取的上層水相未接觸下層酚相。2. 增加75%乙醇的洗滌次數(shù)或用量，確保洗凈鹽分和殘留試劑。

測(cè)量溶液pH值過(guò)低

使用TE緩沖液（pH 8.0）代替RNase-free水稀釋樣品和空白對(duì)照，可校正pH導(dǎo)致的比值偏低。

異硫氰酸胍殘留

裂解液中的胍鹽如果未被充分洗掉，會(huì)強(qiáng)烈吸收230 nm。用75%乙醇徹-底洗滌沉淀2-3次，并確保最后-次吸盡殘留乙醇。

多糖污染

對(duì)于植物組織，可在RNA沉淀后，使用高鹽溶液（如3M乙酸鈉，pH 5.2）配合乙醇進(jìn)行沉淀，以沉淀RNA而讓多糖留在上清。

樣品不新鮮或反復(fù)凍融

采集樣品后應(yīng)立即處理或速凍后保存于-80°C，避免在-20°C長(zhǎng)期存放。提取的RNA應(yīng)小份分裝，避免反復(fù)凍融。

操作環(huán)境中存在RNase污染

回顧專題一：檢查手套是否常換，耗材是否RNase-free，臺(tái)面是否清潔。使用RNase清除劑處理所有表面。

提取過(guò)程中內(nèi)源性RNase未被及時(shí)抑制

確保樣本一接觸裂解液就立即充分混勻，因?yàn)榱呀庖褐械膹?qiáng)變性劑能迅速滅活RNase。對(duì)于富含RNase的組織（如胰腺、脾臟），操作要更快。

樣品在錯(cuò)誤溫度下存放

裂解前的勻漿步驟應(yīng)在冰上或液氮中進(jìn)行。裂解后的樣品在加入有機(jī)溶劑前，室溫孵育時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。

吸取水相時(shí)混入了中間相

TRIzol法中，水相和中間相界限有時(shí)不清。下次操作時(shí)，寧可少取，也不要貪多。

樣品起始量過(guò)大

過(guò)多的樣本量超過(guò)了裂解試劑的緩沖能力，導(dǎo)致DNA未能有效分離。減少樣本起始量。

裂解液與氯仿混勻不充分

加入氯仿后，務(wù)必-用手劇烈搖晃15秒，確保兩相充分接觸，使DNA完-全進(jìn)入中間相。

不可避免的DNA殘留

對(duì)于對(duì)DNA污染容忍度極低的下游實(shí)驗(yàn)（如RT-qPCR跨越內(nèi)含子的引物設(shè)計(jì)），可在RNA溶解后，用無(wú)RNase的DNase I進(jìn)行消化處理，然后再進(jìn)行純化回收。

RNA沉淀過(guò)度干燥

這是常見(jiàn)原因。干燥至沉淀變透明即可，切勿等到干裂。

加入的水量不足

對(duì)于大量RNA沉淀，需加入足夠體積的水（如50-100 μL）。

溶解不充分

加入水后，可在室溫放置幾分鐘，然后用移液器反復(fù)吹打，或溫和渦旋。必要時(shí)55-60°C助溶，但時(shí)間宜短。