實驗優(yōu)先選用 2~4 周齡 SD 或 Wistar 幼鼠，無菌操作下剝離膝關(guān)節(jié)、股骨頭處透明軟骨，修剪成 1mm³ 左右細小組織塊。先用胰蛋白酶短暫預處理去除軟組織，再加入 Ⅱ 型膠原酶置于 37℃恒溫搖床消化，充分分解細胞外基質(zhì)。消化完成后用培養(yǎng)基終止反應，經(jīng)濾網(wǎng)過濾、離心收集細胞沉淀，去除雜質(zhì)與酶液。

采用 DMEM/F12 培養(yǎng)基，添加 10% 胎牛血清、雙抗配制培養(yǎng)液。將細胞重懸后按適宜密度接種于培養(yǎng)瓶，置于 37℃、5% CO?飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。原代細胞初期貼壁較慢，培養(yǎng) 24~48 小時后基本完成貼壁，鏡下呈多邊形、鋪路石樣形態(tài)。

細胞匯合度達 80%~90% 時進行傳代，依舊使用胰酶消化，操作輕柔以減少細胞損傷。軟骨細胞P0~P3 代生物學特性穩(wěn)定，傳代次數(shù)過多會發(fā)生去分化，細胞逐漸變?yōu)殚L梭形，功能蛋白表達下降，實驗需嚴格限定傳代代數(shù)。日常定期更換培養(yǎng)液，清除漂浮死細胞，維持細胞正常生長狀態(tài)。

借助光學顯微鏡觀察，正常軟骨細胞胞體飽滿，胞質(zhì)均勻，多呈多邊形、卵圓形，可形成同源細胞群；若細胞拉長、呈成纖維細胞樣，提示已發(fā)生去分化。

甲苯胺藍染色是經(jīng)典方法，軟骨細胞分泌的糖胺聚糖可與染料結(jié)合，細胞及周圍基質(zhì)呈現(xiàn)特征性紫紅色，以此判定細胞基質(zhì)合成功能正常。

免疫熒光或免疫組化檢測Ⅱ 型膠原，陽性表達為軟骨細胞特異性標志，同時 Ⅰ 型膠原呈陰性，可排除成纖維細胞污染。分子層面通過 qPCR 檢測特征基因，正常細胞高表達 Sox9、Col2a1、聚集蛋白聚糖基因，從基因水平完成精準鑒定。

整套培養(yǎng)與鑒定流程操作規(guī)范、結(jié)果可靠，能為骨關(guān)節(jié)炎、軟骨修復、藥物篩選等相關(guān)研究提供合格的實驗細胞模型。