外泌體作為液體活檢中具有潛力的生物標(biāo)志物，其膜蛋白信息能夠精準(zhǔn)反映疾病狀態(tài)。尤其是腫瘤來源外泌體，因其豐度高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，被認(rèn)為是癌癥早期診斷與疾病監(jiān)測的重要靶點。然而，外泌體的高度異質(zhì)性，使得傳統(tǒng)抗體類識別試劑的開發(fā)面臨巨大挑戰(zhàn)。核酸適配體因具備高親和力、高特異性和可化學(xué)合成等優(yōu)勢，被視為理想的替代分子。然而，基于指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù)（SELEX）的適配體篩選流程，在面對納米尺度、復(fù)雜背景的外泌體時，往往遭遇分離效率低、流程繁瑣、人工干預(yù)多等難題，嚴(yán)重制約了外泌體靶向適配體的研發(fā)效率與臨床轉(zhuǎn)化。如何讓這一高度依賴經(jīng)驗、耗時耗力的篩選過程“穩(wěn)定地自動運行"，成為液體活檢領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問題。

近日，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)蘇州高等研究院葉海航特任研究員、潘挺睿教授，與中國科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所裴仁軍研究員團隊通力合作，成功研發(fā)出集成微流控技術(shù)的自動化機器人平臺DREAMbot，實現(xiàn)了外泌體靶向的適配體多輪自動化篩選，大幅降低人工干預(yù)并提升篩選效率與一致性。相關(guān)研究成果以 “Deterministic Evolution of Aptamers via a Microfluidic-integrated Robotic Platform Using Complex Exosomes as Targets" 為題發(fā)表，為液體活檢領(lǐng)域的適配體開發(fā)提供了一種實用化的新框架。

破解納米級外泌體篩選的“物理瓶頸"

適配體體外篩選的核心難點在于如何在復(fù)雜背景中實現(xiàn)納米級外泌體的高效分離、純化，并可靠富集特異性結(jié)合序列。傳統(tǒng)SELEX流程依賴超速離心等外泌體分離方法，回收率有限且易混雜其他雜志；磁珠法和毛細(xì)管電泳法雖然在一定程度上提升了分離效率，但仍存在篩選偏倚或流程復(fù)雜的問題。與此同時，現(xiàn)有自動化微流控SELEX平臺在靶點靈活性方面存在不足，難以適配外泌體高度異質(zhì)的特性。針對這些長期存在的技術(shù)痛點，研究團隊設(shè)計并構(gòu)建了模塊化的DREAMbot平臺，有機整合三大核心模塊：首先，可編程移液機器臂負(fù)責(zé)精準(zhǔn)執(zhí)行多輪篩選中的液體操作與樣品轉(zhuǎn)移，顯著降低人工干預(yù)帶來的不確定性。其次，DLD分選芯片通過微柱陣列結(jié)構(gòu)設(shè)計，構(gòu)建雙區(qū)域尺寸分選體系，可高效將外泌體從細(xì)胞原液中分離出來，去除細(xì)胞及大尺寸細(xì)胞外囊泡等雜質(zhì)，對納米級顆粒的回收率超過90%，該芯片是使用摩方精密面投影微立體光刻（PμSL）技術(shù)（microArch® S240，精度：10 μm）制備而成。第三，磁控微流控芯片利用脂質(zhì)修飾磁珠，通過脂質(zhì)插入外泌體膜的方式捕獲完整外泌體群體，避免了傳統(tǒng)免疫磁分離對特定表面標(biāo)志物的依賴，從而減少篩選偏倚，并實現(xiàn)適配體-外泌體復(fù)合物的高效純化與洗脫。通過軟件控制，DREAMbot可自動完成孵育、尺寸分選、磁捕獲純化、適配體洗脫及多輪迭代篩選，大幅簡化了傳統(tǒng)SELEX的操作流程。

更少輪次，穩(wěn)定獲得高親和力適配體

為驗證平臺性能，研究團隊首先以鏈霉親和素包被磁珠為陽性靶標(biāo)、蛋白A包被磁珠為陰性靶標(biāo)，開展等效單輪SELEX實驗。結(jié)果顯示，在低選擇壓力條件下，DREAMbot對陽性靶標(biāo)適配體的回收率可達(dá)80%，在高選擇壓力下仍保持約 60%，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)手動磁分離方法，并能有效去除非特異性結(jié)合序列。

在此基礎(chǔ)上，研究團隊以肝細(xì)胞癌特異性標(biāo)志物GPC3陽性外泌體為靶向目標(biāo)，分別從細(xì)胞培養(yǎng)上清和人血清樣本中開展適配體篩選，并與傳統(tǒng)手動SELEX方法進行平行對比。結(jié)果表明，DREAMbot僅需7–9輪篩選即可實現(xiàn)高親和力適配體的富集并進入平臺期，而手動方法通常需要10–11輪，顯著縮短了篩選周期。通過高通量測序和酶聯(lián)寡核苷酸分析（ELONA），團隊篩選得到的適配體Apt-1對GPC3的解離常數(shù)（Kd）達(dá)到5.21 nM，展現(xiàn)出納摩爾級的高親和力，同時對CD63、CD81、CD9等外泌體常見四跨膜蛋白無明顯交叉結(jié)合。

真實樣本驗證，展現(xiàn)臨床應(yīng)用潛力

進一步的流式細(xì)胞術(shù)驗證顯示，該適配體不僅能特異性識別細(xì)胞來源的GPC3陽性外泌體，對肝癌患者血清來源的外泌體同樣產(chǎn)生強結(jié)合信號，陽性率達(dá)到59.3%–63.4%；相比之下，健康人血清外泌體的結(jié)合信號低于13.4%。這一結(jié)果表明，DREAMbot平臺篩選得到的適配體在真實臨床樣本檢測中具備良好應(yīng)用潛力。此外，研究團隊針對通用外泌體標(biāo)志物 CD63 的適配體篩選也取得了類似效果，進一步驗證了該平臺對不同外泌體靶點的適用性。

從“人工經(jīng)驗"走向“可復(fù)制運行"，為液體活檢與生物篩選提供新工具

值得注意的是，DREAMbot采用開放式、模塊化架構(gòu)，輸出樣品格式兼容微孔板讀數(shù)儀、流式細(xì)胞儀、光譜儀等常規(guī)分析設(shè)備，無需額外定制檢測系統(tǒng)。同時，基于Python的控制軟件實現(xiàn)了移液機器臂、流量控制器和磁致動器的協(xié)同控制，使非微流控專業(yè)人員也能便捷開展相關(guān)實驗。盡管目前平臺仍需少量人工操作完成PCR擴增等離線操作，但其已實現(xiàn)SELEX核心流程的自動化執(zhí)行，為未來全流程端到端自動化奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述，中國科大團隊研發(fā)的DREAMbot平臺，通過將DLD分選與脂質(zhì)輔助磁分離技術(shù)集成于自動化機器人系統(tǒng)，成功解決了納米級外泌體在 SELEX中的分離與富集難題，實現(xiàn)了復(fù)雜背景下外泌體靶向的適配體高效、穩(wěn)定和自動化篩選。