荷蘭Liposoma是巨噬細胞清除劑Clodronate Liposomes氯膦酸鹽脂質(zhì)體的發(fā)明人和開發(fā)者。作為金標準的體內(nèi)單核巨噬細胞清除試劑，其憑借穩(wěn)定的化學性質(zhì)、高效的清除能力及良好的生物相容性，已成為全球單核巨噬細胞清除的不二藥物。產(chǎn)品被引頻頻見刊Cell，Nature和Science，助力突破發(fā)現(xiàn)，拓展科學邊界。

巨噬細胞是參與廣泛生理和病理過程的關(guān)鍵高度異質(zhì)性先天免疫細胞。使用ClodronateLiposomes氯膦酸鹽脂質(zhì)體清除巨噬細胞通常用于研究小鼠體內(nèi)巨噬細胞的功能。對受體小鼠巨噬細胞先清除，然后回輸供體的巨噬細胞細胞，在疾病模型中研究回輸巨噬細胞的功能。本Protocol以LPS膿毒癥模型為例，用體外分化、慢病毒轉(zhuǎn)導的骨髓源性巨噬細胞（BMDMs）對受體小鼠回輸，先使用荷蘭Liposoma的ClodronateLiposomes氯膦酸鹽脂質(zhì)體清除受體小鼠巨噬細胞，然后回輸供體小鼠來源巨噬細胞進行重建。該實驗策略可靈活應用于其他實驗方案。實驗框架設計如下：

實驗步驟

一. 骨髓細胞分離

可以參考公眾號：Target Technology關(guān)于，有詳細的protocol（Protocol：小鼠骨髓巨噬細胞的分離，分型和分選）。

1.使用CO2裝置麻醉小鼠，隨后進行頸椎脫臼。

2.用鑷子和剪刀去除骨骼上的皮膚及骨骼肌組織，并在10 cm培養(yǎng)皿中用冷PBS洗滌骨骼。

a. 將骨骼放入含PBS的新10 cm培養(yǎng)皿中，在膝關(guān)節(jié)處剪斷，分離股骨和脛骨。

b. 去除殘留組織，并在新培養(yǎng)皿中再次用PBS洗滌。

注意：須清除骨骼上的骨骼肌，以避免組織細胞污染。

3.用含2% FBS的冷PBS灌滿3 mL注射器。

a. 剪去骨骼兩端，輕柔地將連接28號針頭的注射器插入骨髓腔，推動PBS溶液，沖洗骨髓并將其收集于空的10 cm培養(yǎng)皿中。

b. 用PBS/FBS溶液重新灌滿注射器，重復該步驟，直至所有骨髓組織均被沖洗至培養(yǎng)皿中。

注意：PBS/FBS溶液需在每次骨髓分離前新鮮配制。

當骨髓被沖洗后，骨的顏色由深紅色變?yōu)榘咨ㄒ妶D 1A）。

所獲得的骨髓細胞數(shù)量取決于小鼠的年齡與遺傳背景。通常以6–8周齡小鼠作為理想的骨髓供體。

4.用5 mL移液管輕柔地上下吹打 PBS/FBS/骨髓混合物數(shù)次，以充分分散骨髓組織。然后將溶液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，繼續(xù)上下吹打數(shù)次。將離心管置于冰上。

5.裂解紅細胞（一般不建議，建議重點公眾號的protocol）。

a. 離心機（1400 rpm）在25℃下離心5分鐘，以沉淀細胞。

b. 吸取上清液。加入5 mL紅細胞裂解液和1 mL FBS。重懸細胞，并在室溫下孵育5分鐘裂解紅細胞。

注意：紅細胞裂解緩沖液對骨髓細胞有毒性。加入FBS可降低細胞毒性并提高細胞活性。

6用冷PBS清洗細胞。

a. 1400 rpm離心5分鐘（4℃）沉淀細胞。

b. 將細胞重懸于10 mL冷PBS中，再次離心（1400 rpm）5分鐘沉淀細胞。

c. 重復清洗兩次。

7.將細胞重懸于1 mL預熱至37℃的RPMI 1640充分培養(yǎng)基中。隨后加入含有6 mL預熱RPMI 1640充分培養(yǎng)基（表2）的10 cm細胞培養(yǎng)皿。

8.在37℃和5% CO2下孵育5小時去除基質(zhì)細胞。

注意：5小時后，基質(zhì)細胞會附著在培養(yǎng)皿表面，而骨髓干細胞和前體細胞保持未附著或懸浮狀態(tài)（圖 1B）。

關(guān)鍵： 此步驟對于去除基質(zhì)細胞是必需的，如果允許其生長，它們會附著在培養(yǎng)皿上并與分化的BMDMs混合無法區(qū)分。此步驟對于BMDMs的純度至關(guān)重要。

9.于5小時后，小心收集含有未附著細胞的培養(yǎng)基至 15 mL離心管中。注意不要擾動附著的細胞。

a. 1400 rpm離心5分鐘（4℃）沉淀細胞，并將細胞重懸于1 mL RPMI 1640充分培養(yǎng)基中。

b. 使用血球計數(shù)板（Cat#84107ES）計數(shù)細胞數(shù)量

圖 1. 骨髓來源巨噬細胞（BMDMs）的制備

(A) 小鼠長骨在骨髓沖洗前后的狀態(tài)對比。(B) 幾個關(guān)鍵時間點的代表性細胞圖像。

二.慢病毒轉(zhuǎn)導

在此方案中，我們在BM細胞分化為BMDMs之前使用慢病毒介導的DNA轉(zhuǎn)移來修飾 BM 細胞 (Miller and Blystone, 2015)。在我們的實驗中，我們用攜帶SOCS1 cDNA的慢病毒（SOCS1-慢病毒）轉(zhuǎn)導BM細胞，使用GFP-慢病毒作為對照 (Du et al., 2020)。我們發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)導BM前體細胞比直接轉(zhuǎn)導充分分化的BMDMs更能有效地將基因遞送到BMDMs中。

1.將1 mL BM細胞（最多2x106個細胞）加入到含有6 mL RPMI 1640培養(yǎng)基的新10 cm細胞培養(yǎng)皿中。

注意：通常從小鼠身上可以獲得1-5 x 106個骨髓細胞，具體取決于小鼠的年齡和大小。

2.解凍慢病毒儲備液。向慢病毒溶液（0.1-0.2 mL）中加入Polybrene至終濃度為6 μg/mL。在25℃下孵育5分鐘。

關(guān)鍵：Polybrene對于提高慢病毒轉(zhuǎn)導效率是必需的?；驹硎荘olybrene可以中和細胞表面和病毒顆粒之間的電荷排斥。

3.將慢病毒-Polybrene復合物以10的感染復數(shù) (M.O.I.) 加入培養(yǎng)皿中的BM細胞。在 37℃和5% CO2下孵育細胞48小時。

三.BMDM制備和分化

使用細胞因子將轉(zhuǎn)導的BM細胞分化為 BMDMs。（公眾號：Target Technology，Protocol：小鼠骨髓衍生巨噬細胞（BMDM）的制備）

1.培養(yǎng)48小時后，小心吸出含有慢病毒的培養(yǎng)基，并替換為分化培養(yǎng)基。

注意：此時大多數(shù)BM細胞已附著在培養(yǎng)板上。

2.在37℃和5% CO2下繼續(xù)培養(yǎng)7天。每2天更換一次新鮮的分化培養(yǎng)基。

注意：7天后，培養(yǎng)細胞（BMDMs）的形狀顯得更長且更像橢圓形（圖 1B）。

轉(zhuǎn)導的BMDMs呈GFP陽性。可以通過在熒光顯微鏡下觀察細胞來估計轉(zhuǎn)導效率?？梢酝ㄟ^Western blot評估遞送基因（如 SOCS1）的表達。

四. 脂質(zhì)體注射

為了清除巨噬細胞，需要將含氯膦酸鹽的脂質(zhì)體（Cat#： C-005）靜脈注射到小鼠體內(nèi)。我們通過眼眶后靜脈竇注射這些脂質(zhì)體(Yardeni et al., 2011)。

1.注射前兩小時，取出氯膦酸鹽脂質(zhì)體（Cat# ：C-005）和對照脂質(zhì)體（Cat#：P-005），使其平衡至室溫。

注意：氯膦酸鹽脂質(zhì)體和PBS脂質(zhì)體（對照脂質(zhì)體）儲存在4℃，不可凍存。

2.顛倒脂質(zhì)體管幾次（8-10次），直到液體變得均勻。

3.使用帶有28號針頭的1 mL注射器吸取0.2 mL氯膦酸鹽脂質(zhì)體或?qū)φ罩|(zhì)體。

關(guān)鍵：注射小鼠前務必去除任何氣泡。將空氣注入靜脈可能導致死亡。

4.在II級B2型生物安全柜中使用精密蒸發(fā)器用異氟烷麻醉小鼠。

a. 將小鼠放入腔室并緊緊蓋上蓋子。

b. 將氧氣流量計和異氟烷蒸發(fā)器設置分別調(diào)整為1 L和0.05-4%。

c. 等待小鼠進入深度昏迷狀態(tài)，然后將其從腔室中取出。可以通過足部反射消失來確認麻醉。

注意：當小鼠側(cè)臥時呼吸會變得有節(jié)奏，證明小鼠處于適當麻醉狀態(tài)。不要讓小鼠過度暴露于異氟烷，過度暴露可能導致小鼠死亡。由于麻醉的小鼠可能在15秒內(nèi)醒來，注射應在6-7秒內(nèi)完成。

5.注射前立即通過顛倒含有脂質(zhì)體的注射器6-8次來重懸脂質(zhì)體溶液，使脂質(zhì)體液體均勻。

6.緩慢將0.2 mL脂質(zhì)體注射到眼眶后竇中。

a. 注射時，將麻醉的小鼠側(cè)放，拉開眼睛上方和下方的皮膚，使眼睛略微突出。

b. 在眼底，將針頭在內(nèi)眥處以約30°角插入眼眶后竇（見圖2）。有關(guān)眼眶后注射的更多詳細信息，請參閱參考文獻 (Yardeni et al., 2011)。

注意：如果針頭插入正確位置，應該感覺不到阻力，注射后出血很少或不出血。脂質(zhì)體溶液也可以從尾靜脈注射或腹腔注射。

7.注射完成后，將小鼠放回籠中。

注意：需觀察小鼠，確保其從麻醉中恢復后方可離開。小鼠通常需要15-20秒恢復。

圖2.使用1 mL注射器進行小鼠眼眶后靜脈注射

五.巨噬細胞清除效果驗證

注射脂質(zhì)體48小時后，可以通過使用熒光激活細胞分選 (FACS) 分析脾臟中的F4/80+常駐巨噬細胞來確認巨噬細胞的消除。需要此驗證步驟來建立實驗條件。一旦建立了最佳實驗條件，此步驟并不總是必要的。

1.注射脂質(zhì)體48小時后，使用CO2處死小鼠，隨后進行頸椎脫臼。

a. 立即用70%乙醇消毒皮膚，用手術(shù)剪打開腹腔并采集脾臟。

b. 將脾臟放入裝滿含有10% FBS的冷RPMI1640的10 cm培養(yǎng)皿中。

2.將脾臟放在70 μm細胞篩上，使用1 mL注射器的末端將脾臟搗碎穿過細胞篩。將過濾后的細胞懸液收集到15 mL管中。

a. 離心細胞（1400 rpm，5分鐘，4℃）。將細胞重懸于5 mL紅細胞裂解緩沖液中，并在25℃下孵育5分鐘以裂解紅細胞。

b. 加入10 mL冷PBS。離心（1400 rpm，5分鐘）收集細胞。

c. 通過重復此步驟再次用冷PBS清洗細胞。將細胞保持在冰上。

3.FACS分析。

a. 將細胞在0.1 mL Live and Dead Violet Viability 溶液中于冰上孵育30分鐘。用冷 PBS 清洗細胞一次并離心（1400 rpm，5分鐘，4℃）?？捎肅alcein-AM/PI 活細胞/死細胞雙染試劑盒代替

b. 用抗小鼠MHCII FITC（1:200稀釋）和抗小鼠F4/80 APC（1:200稀釋）在黑暗中于冰上染色細胞30分鐘。用冷PBS清洗細胞一次。

c. 使用BD LSRFortessa儀器進行FACS分析。

d. 使用FlowJo軟件(V10)分析FACS數(shù)據(jù)（圖3）。

注意：通常在注射一次氯膦酸鹽脂質(zhì)體48小時后，可以觀察到常駐巨噬細胞的成功清除（減少>90%）。圖3顯示了在48小時后注射一劑或兩劑氯膦酸鹽脂質(zhì)體后脾臟巨噬細胞清除的示例 (Du et al., 2020)。

圖3. FACS驗證巨噬細胞清除

A.小鼠脾臟巨噬細胞在用對照脂質(zhì)體、一次或兩次氯膦酸酯脂質(zhì)體處理后48小時的代表性FACS分析圖。***p<0.001，單因素方差分析。B.FACS分析的定量數(shù)據(jù)（數(shù)據(jù)引自doi:10.1016/j.devcel.2020.10.023）。

六.巨噬細胞重建

氯膦酸鹽脂質(zhì)體處理兩天后，可以用新的巨噬細胞重建巨噬細胞清除后的小鼠。在此方案中，我們使用了慢病毒轉(zhuǎn)導的BMDMs。這些BMDMs通過眼眶后靜脈竇靜脈注射遞送至小鼠體內(nèi)。由于內(nèi)源性巨噬細胞會在清除后1-2周內(nèi)重新填充小鼠 (van Rooijen et al., 1989)，因此只有4-5天的時間窗口可以在小鼠中檢測外源性巨噬細胞。

因此，至關(guān)重要的是要規(guī)劃實驗，以便BMDM的體外分化在此窗口期內(nèi)完成并準備好使用。

1.吸出BMDMs的培養(yǎng)基，用10 mL PBS清洗細胞。加入5 mL Trypsin-EDTA并在 37℃下孵育5分鐘以使細胞從培養(yǎng)板上解離。

注意：BMDMs通常在條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)第7天即可使用。分化的BMDMs示例見圖 1B。

2.使用無菌細胞刮刀將細胞從培養(yǎng)板上刮下。

a. 將細胞轉(zhuǎn)移到50 mL錐形管中。用5 mL PBS (pH 7.0)沖洗培養(yǎng)皿2-3次，并將沖洗液轉(zhuǎn)移到含有收獲細胞的離心管中。

b. 輕輕吹打細胞溶液幾次以分散細胞團塊。

3.1400 rpm離心5分鐘（25℃）沉淀細胞。用無菌PBS (pH 7.0)清洗細胞 2-3 次。

4.用5 mL無菌PBS重懸細胞。用血細胞計數(shù)板計數(shù)細胞。

5.1400 rpm離心5分鐘（25℃）沉淀細胞。去除上清液，并將細胞重懸于無菌PBS中，濃度為107個細胞/mL。

6.如上所述，使用異氟烷麻醉受體小鼠（巨噬細胞清除后的小鼠）。

7.用1 mL注射器吸取0.2 mL細胞溶液。使用28號針頭通過眼眶后靜脈竇緩慢注射0.2 mL BMDM溶液。

注意：每只小鼠注射2 x 106個BMDMs?？梢宰⑸?.2 mL PBS作為對照。BMDM溶液也可以通過尾靜脈注射。

8.注射完成后，將小鼠放回籠中。

注意：需觀察小鼠，確保其從麻醉中恢復后方可離開。

七.LPS誘導的膿毒癥與分析

重建后的小鼠是研究外源性巨噬細胞的體內(nèi)平臺。BMDM注射36小時后，小鼠即可用于實驗。在此方案中，我們使用LPS誘導的膿毒癥模型來研究重建BMDMs的體內(nèi)功能 (Du et al., 2020)。

1.將LPS溶解在無菌 PBS (pH 7.0) 中，濃度為10 mg/mL。

2.稱量小鼠體重。根據(jù)體重，計算要注射給小鼠的LPS溶液體積，劑量為20 μg/kg（體重）。

注意：對于LPS模型，小鼠的理想體重應>18克。

3.用1 mL注射器取適量的LPS溶液，并使用28號針頭腹膜內(nèi)注射小鼠。

注意：注射時，在小鼠腹部右下象限以30°-40°角插入針頭。一旦針頭穿過皮膚和腹膜襯里，角度應與胃平行以避免刺穿器官。PBS可用作注射對照。

4.分析小鼠。

注意：LPS注射后幾小時內(nèi)，小鼠會出現(xiàn)體溫過低，在此LPS劑量下，多達50%的C57BL/6小鼠可能在72小時內(nèi)死亡。LPS注射會引起嚴重的全身炎癥和多器官損傷?？梢栽诓煌瑫r間點處死小鼠進行分析。

八.預期結(jié)果

在本研究中，我們旨在評估SOCS1是否在YTHDF1下游發(fā)揮調(diào)節(jié)巨噬細胞激活的作用。為此，我們從野生型(WT)和YTHDF1(-/-)小鼠中衍生出BMDMs，然后分別用SOCS1-慢病毒或GFP (Ctrl)-慢病毒轉(zhuǎn)導這些WT和YTHDF1(-/-) BMDMs。我們清除了WT小鼠的巨噬細胞，然后用SOCS1-或GFP (Ctrl)-轉(zhuǎn)導的WT或YTHDF1(-/-) BMDMs重建這些小鼠。最后，我們將這些重建的小鼠置于LPS誘導的膿毒癥模型中。如圖4所示，與接受Ctrl-轉(zhuǎn)導WT BMDMs的小鼠相比，接受 Ctrl-轉(zhuǎn)導 YTHDF1(-/-) BMDMs 的小鼠在 LPS 攻擊后死亡率要高得多（24 小時內(nèi) 100% 死亡）（圖 4A），這是預期的。接受 Ctrl-轉(zhuǎn)導 YTHDF1(-/-) BMDMs 的小鼠產(chǎn)生的血清炎癥細胞因子水平遠高于接受 Ctrl-轉(zhuǎn)導 WT BMDMs 的小鼠（圖 4B），這也是預期的。這些觀察結(jié)果表明慢病毒轉(zhuǎn)導和清除/重建程序均成功（因為所有受體小鼠均為 WT 小鼠，如果程序不起作用，受體小鼠的表型應相同）。當接受 SOCS1-轉(zhuǎn)導 YTHDF1(-/-) BMDMs 的小鼠接受 LPS 治療時，高死亡率得到了預防（圖 4A），并且血清炎癥細胞因子水平降低到了 Ctrl 水平（圖 4B）。這些數(shù)據(jù)表明，清除/重建程序確實是研究外源性巨噬細胞體內(nèi)功能的系統(tǒng)。

圖 4. 過表達 SOCS1 可糾正小鼠 YTHDF1?/?巨噬細胞的過度炎癥表型

(A) 經(jīng) LPS 刺激后，分別回輸野生型（WT）或 YTHDF1?/?骨髓來源巨噬細胞（BMDMs）（并轉(zhuǎn)染 SOCS1 慢病毒或?qū)φ章《荆┑木奘杉毎蕹∈蟮纳媲€；p < 0.0001（YTHDF1?/? + 對照 + LPS 組與其余各組比較）。

(B) 經(jīng) LPS 刺激后，分別回輸野生型（WT）或 YTHDF1?/?骨髓來源巨噬細胞（BMDMs）（并轉(zhuǎn)染 SOCS1 慢病毒或?qū)φ章《荆┑木奘杉毎蕹∈蟮难寮毎蜃訚舛取?p < 0.05，**p < 0.01；*p < 0.001，****p < 0.0001，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。所有數(shù)據(jù)均以平均值 ± 標準差（mean ± SD）** 表示。