庫普弗細(xì)胞（Kupffer Cells）｜肝臟免疫的守門人，肝病研究的核心靶點(diǎn)

摘要：庫普弗細(xì)胞是肝臟免疫核心，參與DILI、NASH、肝纖維化等疾病進(jìn)程，是肝病研究與新藥研發(fā)核心靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：庫普弗細(xì)胞、Kupffer Cells、藥物性肝損傷、原代庫普弗細(xì)胞、DILI、NASH機(jī)制、肝纖維化靶點(diǎn)、肝臟免疫、肝病藥物研發(fā)、肝臟巨噬細(xì)胞

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庫普弗細(xì)胞（Kupffer Cells）是定居于肝臟血竇內(nèi)的常駐巨噬細(xì)胞，占人體全身巨噬細(xì)胞總量的80%以上，是肝臟固有免疫系統(tǒng)的核心組成部分。作為腸道血液進(jìn)入體循環(huán)的初始免疫屏障，Kupffer細(xì)胞不僅負(fù)責(zé)清除血源性病原體、維持肝臟穩(wěn)態(tài)，更是藥物性肝損傷、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝纖維化、肝癌等幾乎所有肝臟疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)控者。近年來，隨著單細(xì)胞測(cè)序和類器官技術(shù)的發(fā)展，Kupffer細(xì)胞的異質(zhì)性和功能復(fù)雜性被逐步揭示，成為肝病機(jī)制研究和新藥研發(fā)的核心靶點(diǎn)。

一、庫普弗細(xì)胞基本特征與發(fā)育穩(wěn)態(tài)

1.解剖定位：肝竇內(nèi)的免疫哨兵

Kupffer細(xì)胞特異性分布于肝臟肝小葉的肝竇腔內(nèi)，且呈現(xiàn)明顯的門周區(qū)富集特征——靠近門靜脈的肝竇段Kupffer細(xì)胞密度較高，越靠近中央靜脈數(shù)量越少。這種空間分布與肝臟的免疫防御功能高度匹配：門靜脈攜帶來自腸道的營養(yǎng)和潛在病原體，門周區(qū)富集的Kupffer細(xì)胞可快速攔截并清除入侵的微生物。

形態(tài)上，Kupffer細(xì)胞呈星形，伸出大量偽足。其細(xì)胞體附著于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞表面，偽足可穿過內(nèi)皮細(xì)胞間隙延伸至Disse間隙，與肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞（HSCs）直接接觸，形成精密的細(xì)胞互作網(wǎng)絡(luò)。

2.庫普弗細(xì)胞的發(fā)育起源與穩(wěn)態(tài)維持

穩(wěn)態(tài)下庫普弗細(xì)胞并非由骨髓單核細(xì)胞分化而來，而是起源于胚胎卵黃囊紅髓系前體（EMPs），小鼠胚胎E8.5–E9.5 定植肝臟，出生后P7遷移入肝竇發(fā)育成熟并獲得完整吞噬功能。成年后主要依靠局部自我更新維持細(xì)胞群體穩(wěn)定；僅在毒素、感染造成大量細(xì)胞損耗時(shí)，骨髓Ly6C?單核細(xì)胞才會(huì)募集至肝臟，依托肝星狀細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞構(gòu)成的生態(tài)位信號(hào)，分化補(bǔ)充為成熟庫普弗細(xì)胞。

圖1.肝臟巨噬細(xì)胞的分布與肝小葉結(jié)構(gòu)示意圖。庫普弗細(xì)胞（Kupffer cells）富集于門周區(qū)肝竇內(nèi)。

二、庫普弗細(xì)胞核心生理功能：肝臟穩(wěn)態(tài)的多面手

1.血液病原體清除：初始免疫屏障

Kupffer細(xì)胞核心的功能是濾過門靜脈血，維持血液無菌狀態(tài)。其表面的補(bǔ)體受體CRIg具有獨(dú)特的“捕獲鍵"特性，可在肝竇高血流動(dòng)力學(xué)條件下結(jié)合并吞噬細(xì)菌、病毒、真菌等病原體。研究顯示，血液初次流經(jīng)肝臟時(shí)，90%以上的血源性病原體可被Kupffer細(xì)胞捕獲清除；小鼠缺失Kupffer細(xì)胞后，金黃色葡萄球菌感染48小時(shí)死亡率很高。

2.衰老細(xì)胞與異物清除：維持循環(huán)穩(wěn)態(tài)

Kupffer細(xì)胞負(fù)責(zé)清除血液循環(huán)中衰老的血小板和紅細(xì)胞：

· 衰老血小板因表面唾液酸丟失，被Kupffer細(xì)胞表面的Clec4f、Ashwell-Morell受體識(shí)別并吞噬；

· 作為脾臟的補(bǔ)充，Kupffer細(xì)胞可清除衰老紅細(xì)胞，參與鐵代謝和再循環(huán)。

3.抗腫瘤免疫：突破“別吃我"信號(hào)

Kupffer細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗腫瘤功能，其核心機(jī)制是抑制信號(hào)受體SIRPα的表達(dá)，從而能夠識(shí)別并吞噬表達(dá)CD47的腫瘤細(xì)胞。此外，Kupffer細(xì)胞還可分泌細(xì)胞因子激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞，啟動(dòng)適應(yīng)性抗腫瘤免疫應(yīng)答。

三、庫普弗細(xì)胞在肝臟疾病中的雙重作用

庫普弗細(xì)胞功能失衡是各類肝病發(fā)生發(fā)展的核心誘因，可極化為促炎M1型與抗炎促修復(fù)M2型，在疾病中發(fā)揮雙向調(diào)控作用。

1.藥物性肝損傷（DILI）

臨床多數(shù)特異質(zhì)性藥物肝損傷由免疫機(jī)制介導(dǎo)。庫普弗細(xì)胞識(shí)別藥物代謝復(fù)合物后激活炎癥通路，釋放TNF-α、IL-1β 等炎癥因子，招募免疫細(xì)胞誘發(fā)肝細(xì)胞壞死；僅用單一肝細(xì)胞模型難以模擬真實(shí)損傷過程，也是藥物篩選假陰性偏高的重要原因。

2.NAFLD/NASH

游離脂肪酸與腸道LPS可激活庫普弗細(xì)胞向M1極化，誘發(fā)肝臟炎癥與肝細(xì)胞脂肪變性；活化的庫普弗細(xì)胞進(jìn)一步分泌促纖維化因子，激活肝星狀細(xì)胞，加速病程向肝纖維化演進(jìn)。部分庫普弗細(xì)胞可轉(zhuǎn)型為TREM2脂質(zhì)相關(guān)巨噬細(xì)胞，參與細(xì)胞碎片與脂質(zhì)清除、介導(dǎo)損傷修復(fù)。

3.肝纖維化與肝硬化

慢性肝損傷會(huì)破壞庫普弗細(xì)胞生存生態(tài)位，使其免疫防御功能衰退；骨髓單核細(xì)胞可融合形成庫普弗樣合胞體，代償恢復(fù)抑菌清除能力。同時(shí)持續(xù)活化的庫普弗細(xì)胞及脂質(zhì)相關(guān)巨噬細(xì)胞分泌促纖維化因子，持續(xù)推動(dòng)肝纖維化、肝硬化進(jìn)程。

四、科研與轉(zhuǎn)化應(yīng)用：肝病研究的核心工具

1.高生理相關(guān)性體外模型構(gòu)建

傳統(tǒng)單一肝細(xì)胞模型存在體外快速去分化、無法復(fù)現(xiàn)炎癥和纖維化表型的缺陷。引入Kupffer細(xì)胞構(gòu)建的多細(xì)胞共培養(yǎng)體系（肝細(xì)胞+Kupffer細(xì)胞+肝星狀細(xì)胞+肝竇內(nèi)皮細(xì)胞），可在體外同步復(fù)現(xiàn)NASH從脂肪變性→炎癥→纖維化的全病理進(jìn)程，是目前抗NASH、抗纖維化藥物篩選的金標(biāo)準(zhǔn)模型，已獲得FDA和EMA的推薦。

2.3D肝臟類器官與生物人工肝

Kupffer細(xì)胞作為核心支持細(xì)胞，與肝細(xì)胞共培養(yǎng)構(gòu)建的3D肝臟類器官，可長期維持肝細(xì)胞的分化狀態(tài)和代謝功能，解決了傳統(tǒng)類器官功能維持時(shí)間短的問題?；贙upffer細(xì)胞的生物人工肝，其解毒能力和免疫防御功能較傳統(tǒng)模型大幅提升，是終末期肝衰竭治療的重要研發(fā)方向。

3.肝靶向藥物遞送

利用Kupffer細(xì)胞的吞噬特性，通過調(diào)控脂質(zhì)體藥物表面的PEG密度，可實(shí)現(xiàn)“捕獲-釋放"式肝靶向遞藥，提升藥物在肝臟的濃度，降低全身毒性。此外，靶向Kupffer細(xì)胞的小分子藥物（如CSF-1R抑制劑）可通過抑制Kupffer細(xì)胞活化，用于治療NASH和肝纖維化。

五、原代庫普弗細(xì)胞（Kupffer Cells）使用及體外培養(yǎng)注意事項(xiàng)

1.kupffer細(xì)胞核心特性

人原代庫普弗細(xì)胞體外不增殖、不可傳代，需一次性復(fù)蘇足量細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞高度敏感，易激活、易脫壁、易結(jié)團(tuán)，全程操作需輕柔、低溫、無菌。

圖2.人原代庫普弗細(xì)胞

2.復(fù)蘇關(guān)鍵步驟

· 水浴復(fù)蘇：37℃快速解凍1.5–2 分鐘，僅留小冰晶即停止。

· 全程低溫：復(fù)蘇、離心前必須置于冰上。

· 離心條件：室溫或4℃條件下以500×g離心5 分鐘

· 輕柔重懸：避免吹打造成細(xì)胞破碎、激活。

· 重要提醒：切勿預(yù)熱培養(yǎng)基以解凍細(xì)胞，庫普弗細(xì)胞在37℃條件下易黏附于錐形管壁，因此不建議使用預(yù)熱的培養(yǎng)基復(fù)蘇。

3.鋪板與貼壁

推薦接種濃度：0.2–0.4×10? cells/mL。

鋪板后輕輕混勻，放入37℃、5% CO?培養(yǎng)箱。

4–6小時(shí)后必須換液，去除未貼壁細(xì)胞與碎片。

4.培養(yǎng)維護(hù)

最長可培養(yǎng)：7天。

換液頻率：每日全量換液，或按實(shí)驗(yàn)需求調(diào)整。

換液動(dòng)作輕柔，避免吸走貼壁細(xì)胞。

5.儲(chǔ)存與運(yùn)輸

儲(chǔ)存條件：氣相液氮-135℃至-190℃。

嚴(yán)禁反復(fù)凍融，簽收后立即轉(zhuǎn)入液氮。

6.質(zhì)量與安全要點(diǎn)

· 每批次附CoA質(zhì)檢報(bào)告，含活率、形態(tài)、LPS 響應(yīng)、無菌檢測(cè)。

· 僅供研究使用，不可用于臨床、診斷。

· 操作按生物安全規(guī)范，廢棄物合規(guī)處理。

六、常見問題FAQ（體外培養(yǎng)與模型構(gòu)建成功率）

Q1：原代庫普弗細(xì)胞復(fù)蘇后存活率低，是什么原因？

A：主要與解凍速度、溫度控制、操作力度相關(guān)。參照LifeNet Health細(xì)胞培養(yǎng)方案：37℃快速解凍1.5–2分鐘，全程冰上操作，輕柔吹打；500×g離心5分鐘，避免過度離心損傷細(xì)胞。確認(rèn)培養(yǎng)基、血清無內(nèi)毒素、無支原體污染。同時(shí)，不預(yù)熱復(fù)蘇培養(yǎng)基，以防庫普弗細(xì)胞在37℃條件下黏附于錐形管壁。

Q2：細(xì)胞貼壁差、易脫落，如何提高貼壁率？

A：建議使用I型膠原蛋白包被培養(yǎng)器皿；鋪板密度控制在0.2–0.4×10? cells/mL；接種后4–6小時(shí)輕柔換液，去除未貼壁細(xì)胞與碎片，可顯著提升貼壁穩(wěn)定性。

Q3：為什么原代庫普弗細(xì)胞不能傳代？

A：人原代庫普弗細(xì)胞體外不增殖，為終末分化細(xì)胞，一旦消化會(huì)大量死亡、功能丟失。因此必須一次性復(fù)蘇足量細(xì)胞完成全部實(shí)驗(yàn)，不可傳代擴(kuò)增。

Q4：如何避免細(xì)胞自發(fā)激活，保證實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性？

A：激活會(huì)導(dǎo)致形態(tài)變圓、吞噬下降、炎癥因子升高。關(guān)鍵控制要點(diǎn)：

· 全程無內(nèi)毒素、無菌、無支原體耗材與試劑

· 避免反復(fù)晃動(dòng)、劇烈吹打、溫度驟變

· 鋪板后4–6小時(shí)換液，減少應(yīng)激刺激

· 盡量在復(fù)蘇后24–72小時(shí)內(nèi)完成功能實(shí)驗(yàn)

Q5：構(gòu)建共培養(yǎng)/類器官模型，成功率低怎么辦？

A：提高模型成功率的核心要點(diǎn)：

先單獨(dú)驗(yàn)證Kupffer細(xì)胞活率、貼壁、形態(tài)正常

接種順序：先鋪肝細(xì)胞/基質(zhì)細(xì)胞，4–12小時(shí)后再加入Kupffer細(xì)胞

控制接種比例，避免Kupffer細(xì)胞過度活化影響體系

使用低激活、低內(nèi)毒素的培養(yǎng)基體系

Q6：最長可培養(yǎng)多少天？如何維持功能穩(wěn)定？

A：參照LifeNet Health細(xì)胞培養(yǎng)方案，可維持最長7天。建議每日換液、保持培養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定，避免干擾。功能實(shí)驗(yàn)（吞噬、LPS刺激、細(xì)胞互作）盡量在72小時(shí)內(nèi)完成，以保證數(shù)據(jù)穩(wěn)定、重復(fù)性最高。

Q7：哪些因素最影響模型構(gòu)建成功率？

A：按影響程度排序：

· 細(xì)胞復(fù)蘇與操作不當(dāng)（占比最高）

· 內(nèi)毒素、支原體污染

· 貼壁與包被不到位

· 換液不及時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞激活

· 培養(yǎng)體系與接種比例不匹配

七、總結(jié)

庫普弗細(xì)胞作為肝臟免疫的核心，既是維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的“守門人"，也是多種肝臟疾病的“始作俑者"。近年來，單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)揭示了Kupffer細(xì)胞的異質(zhì)性和動(dòng)態(tài)可塑性，為肝病治療提供了全新的靶點(diǎn)。高質(zhì)量、高生理相關(guān)性的原代庫普弗細(xì)胞是開展上述機(jī)制研究、藥物靶點(diǎn)驗(yàn)證及新藥篩選的核心工具，上海曼博生物作為LifeNet Health國內(nèi)供應(yīng)商直售原代人肝庫普弗細(xì)胞，并提供配套的細(xì)胞培養(yǎng)、功能驗(yàn)證等一站式技術(shù)支持，助力科研人員攻克肝臟免疫研究中的關(guān)鍵技術(shù)難題。未來，通過調(diào)控Kupffer細(xì)胞的極化、修復(fù)Kupffer細(xì)胞生態(tài)位、構(gòu)建基于Kupffer細(xì)胞的高生理相關(guān)性模型，有望突破肝病治療和新藥研發(fā)的瓶頸，為廣大肝病患者帶來福音。

參考文獻(xiàn)

Nusse, Y., Kubes, P. Liver macrophages: development, dynamics, and functions. Cell Mol Immunol 22, 1178–1189 (2025)

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