英國Nuclera公司的eProtein Discovery是一個無細胞蛋白質(zhì)表達篩選（CFPS）系統(tǒng)，也被稱作體外轉錄/翻譯系統(tǒng)，能夠快速獲得高質(zhì)量、功能性蛋白質(zhì)，從DNA到活性蛋白質(zhì)可在48小時內(nèi)實現(xiàn)蛋白表達篩選，并與Biacore SPR聯(lián)用，在5天內(nèi)完成從DNA到蛋白功能表征的完整流程。該系統(tǒng)可用于蛋白表達優(yōu)化與條件篩選。
該系統(tǒng)采用數(shù)字微流控卡盒和定制試劑，可同時自動篩選多達24種可溶性蛋白或11種膜蛋白、每種蛋白最多8組不同的表達條件，篩選結果可直接應用于體內(nèi)表達，有效指導大腸桿菌菌株選擇和質(zhì)粒設計，加速整體蛋白質(zhì)生產(chǎn)流程。
布魯頓酪氨酸激酶（BTK）是B細胞受體信號通路中的關鍵分子，也是治療白血病、淋巴瘤及自身免疫性疾病的重要靶點。第一代抑制劑（如伊布替尼）面臨著耐藥性（如C481S 突變導致的耐藥）與脫靶效應問題；第二代抑制劑（如阿卡替尼、贊布替尼）雖提升了選擇性，但仍受耐藥性與生物利用度問題的困擾；非共價抑制劑（如非奈布替尼、維卡布替尼）雖對C481S突變型BTK仍有活性，但其與BTK的結合具有可逆性，因此需通過詳細的動力學表征來評估其治療潛力。
本研究展示了Nuclera公司與Cytiva公司合作開發(fā)的一體化解決方案，可將BTK抑制劑篩選從DNA階段到功能表征階段的流程縮短至5天。其中，eProtein Discovery系統(tǒng)能高效表達帶Avi標簽的BTK蛋白（產(chǎn)量高），而Biacore SPR技術可提供詳盡的動力學與功能分析數(shù)據(jù)。這一簡化的工作流程不僅提升了藥物靶點的生產(chǎn)效率、加快了篩選速度，更助力激酶藥物研發(fā)領域?qū)崿F(xiàn)更快速、基于數(shù)據(jù)的決策。
首先，利用整合了數(shù)字微流控技術與無細胞蛋白質(zhì)合成技術的eProtein Discovery系統(tǒng)，篩選蛋白質(zhì)的最佳表達與純化條件；隨后，將篩選出的較優(yōu)條件進行規(guī)模放大，并對所得蛋白質(zhì)進行生物素化修飾；在進行Biacore SPR分析前，需通過緩沖液交換去除樣品中多余的生物素；最后，將生物素化的蛋白質(zhì)直接捕獲到Sensor Chip SA上，借助 Biacore 1S+系統(tǒng)完成藥物-靶點相互作用的表征分析。
圖1：5天工作流程實現(xiàn)從DNA到蛋白質(zhì)表征。
通過eProtein Discovery系統(tǒng)對三種 BTK 基因片段（包括全長片段 1-693、截短變體 211-659，以及單獨的激酶結構域 392-659）進行篩選，評估其在不同可溶性標簽與無細胞表達條件（無細胞混合體系，Cell-free Blends）組合下的可溶性表達水平與純化產(chǎn)量。篩選后，選擇產(chǎn)量最高的構建體BTK392-659，在其N端和C端分別引入Avi標簽，并重復上述篩選過程。隨后，對優(yōu)化后的構建體進行規(guī)模放大生產(chǎn)，最終通過SDS-PAGE驗證蛋白質(zhì)的產(chǎn)量與純度。
采用 BirA 連接酶對純化后的帶Avi標簽BTK蛋白進行生物素化修飾，修飾完成后，使用 Zeba離心脫鹽柱進行緩沖液交換，去除樣品中多余的生物素與BirA連接酶。通過 SDS-PAGE與Streptavidin-A488免疫印跡法驗證生物素化修飾是否成功。
本研究使用Biacore 1S+系統(tǒng)開展 BTK 蛋白的捕獲與表征實驗。
在HBS-P+運行緩沖液中，將濃度為 15-20 μg/mL 的生物素化 BTK 蛋白在 25℃條件下，以 5 μL/min的流速、720秒的接觸時間，捕獲到Sensor Chip SA或Sensor Chip NA上。采用 Biacore SCK檢測法，分析BTK蛋白與抑制劑vecabrutinib、fenebrutinib的結合動力學特征：先將生物素化 BTK 蛋白固定在 Sensor Chip NA 上，固定水平最高達 2000 RU；隨后，將抑制劑以 3 倍稀釋梯度配制為0.4 nM至100 nM 的系列濃度，在25℃條件下以30 μL/min的流速注入系統(tǒng)，設定結合時間為120秒、解離時間為1200秒。實驗中，運行緩沖液與樣品制備均使用pH 7.4的HBS-P+緩沖液，該緩沖液含 10 mM MgCl?與 5% DMSO。
為評估BTK蛋白的表達情況，研究人員首先利用AlphaFold軟件設計了三種BTK構建體（圖 2A），隨后通過eProtein Discovery系統(tǒng)，在一組不同的可溶性標簽與無細胞混合體系條件下對這些構建體進行篩選。
結果顯示：僅含BTK激酶結構域的變體（BTK392-659）在融合FH8標簽后，其表達量是全長BTK蛋白（BTK1-693）的 9 倍（圖 2B）；純化效率也呈現(xiàn)相似趨勢，BTK392-659 的純化蛋白產(chǎn)量是全長 BTK 的 5 倍（圖 2C）。這一結果充分證明，通過對蛋白構建體（如選擇特定結構域、搭配可溶性標簽）進行優(yōu)化，能明顯提升蛋白質(zhì)的產(chǎn)量與穩(wěn)定性。
圖2：利用eProtein Discovery系統(tǒng)對BTK變體進行表達與純化篩選。（A）所篩選BTK變體的AlphaFold結構預測圖。（B）192種條件下的表達篩選結果：在8種添加了不同添加劑的無細胞混合體系中，對攜帶7種可溶性標簽的BTK變體及1組無標簽對照組的表達情況進行評估。（C）30種選定條件下的純化篩選結果：通過這些條件評估BTK變體的純化產(chǎn)量與可溶性。
研究人員將 Avi 標簽分別引入 BTK392-659 蛋白的N端和C端（圖 3A），以評估標簽位置對蛋白生產(chǎn)的影響。結果顯示，蛋白表達量較之前（圖2B中為6-8 μM）略有下降，降至5-6 μM（圖 3B）。但 Avi 標簽的放置位置并未對蛋白的表達與純化產(chǎn)生不利影響，兩種標簽位置（N端、C端）對應的蛋白預測純化產(chǎn)量均為2.5 μM（圖 3C）。
此外，僅添加Buffer仍是較優(yōu)的添加劑條件；但與此前不同的是，本階段實驗中，ZZ可溶性標簽而非 FH8標簽實現(xiàn)了蛋白產(chǎn)量Max化，這一結果進一步印證了可溶性標簽篩選的重要性。
圖3：利用eProtein Discovery系統(tǒng)對帶Avi標簽的BTK392-659蛋白進行表達與純化篩選。（A）N端和C端帶 Avi標簽的BTK392-659變體的eGene構建體設計圖。（B）表達篩選結果與（C）純化篩選結果：在 8 種無細胞混合體系（Cell-free Blends）中，對攜帶7種可溶性標簽的 Avi-tagged BTK392-659 及 1 組無標簽對照的表達水平、純化效果分別進行檢測；（C）中的灰色柱形代表被選定用于后續(xù)規(guī)模放大生產(chǎn)的實驗條件。
研究人員將兩種含 ZZ可溶性標簽的帶 Avi 標簽 BTK392-659 變體，在 “僅含Buffer" 的無細胞混合體系中進行規(guī)模放大生產(chǎn)，最終獲得了純度合格、濃度為250 μg/mL的純化蛋白（圖 4）。
圖4：利用eProtein Discovery系統(tǒng)對規(guī)模放大生產(chǎn)的帶Avi標簽BTK392-659蛋白進行 SDS-PAGE 分析結果。（A）N 端帶 Avi 標簽的 BTK 蛋白；（B）C 端帶 Avi 標簽的 BTK 蛋白。
采用 BirA 連接酶對帶 Avi 標簽的 BTK 蛋白進行生物素化修飾，隨后通過三輪緩沖液交換去除多余的生物素。Western blot分析證實，N 端和 C 端帶 Avi 標簽的 BTK 蛋白均成功實現(xiàn)生物素化，與未生物素化的對照樣品相比，二者均呈現(xiàn)出強烈的鏈霉親和素信號（圖 5）。該實驗流程僅需極短的處理時間，即可獲得可用于 SPR 分析的蛋白。
圖5：采用Streptavidin-A488對N端和C端帶Avi標簽的BTK392-659蛋白的生物素化情況進行Western blot分析。（A）N 端帶 Avi 標簽的 BTK 蛋白；（B）C 端帶 Avi 標簽的 BTK 蛋白。
研究人員通過Sensor Chip SA與Sensor Chip NA，分析了Avi標簽及生物素化修飾分別位于 N 端和 C 端的 BTK 變體的捕獲效率。圖 6A 顯示了兩種變體在 Sensor Chip SA 上的捕獲水平響應結果：N 端生物素化的 BTK 在兩種芯片上均表現(xiàn)出良好的捕獲水平，而 C 端生物素化的 BTK 結合水平較差，這可能是空間位阻導致的。在 Sensor Chip NA 上也觀察到了類似的捕獲水平（數(shù)據(jù)未展示）。這種簡單的 Biacore 捕獲實驗，可快速證明通過實驗優(yōu)化標簽位置的重要性。
研究人員選擇N端生物素化的BTK變體，進一步開展其與抑制劑fenebrutinib和vecabrutinib的動力學研究。采用 Biacore SCK檢測法分析BTK與抑制劑的結合動力學，并使用 Biacore Insight Evaluation 軟件進行數(shù)據(jù)分析。圖6B展示了fenebrutinib和vecabrutinib與固定在 Sensor Chip NA 上的 BTK 的結合情況，證實了eProtein Discovery系統(tǒng)表達的 BTK 對其抑制劑具有活性。fenebrutinib與商用BTK的結合曲線也呈現(xiàn)出類似特征（數(shù)據(jù)未展示）。
圖6：（A）N端和C端帶Avi標簽的BTK392-659變體在Sensor Chip SA上的Biacore SPR 傳感器圖。（B）Fenebrutinib和vecabrutinib與N端生物素化BTK（SOL-Avi-BTK392-659）結合的Biacore 單循環(huán)動力學傳感器圖。
在藥物研發(fā)中，理解藥物與靶點相互作用的構效關系至關重要，因為它直接影響藥物的療效與選擇性。本研究展示了一套經(jīng)過優(yōu)化的高效工作流程，可用于快速生產(chǎn)和表征布魯頓酪氨酸激酶（BTK）。
通過將Nuclera公司的eProtein Discovery系統(tǒng)與Cytiva公司的Biacore SPR技術相結合，研究人員能在 5 天內(nèi)完成藥物靶點的篩選、規(guī)模放大、捕獲與表征工作，大幅加快了抑制劑篩選與先導化合物優(yōu)化的進程。最終，這一新一代技術方案為藥物研發(fā)提供了更快速、基于數(shù)據(jù)的決策支持，助力加速開發(fā)出選擇性更強、療效更優(yōu)的激酶抑制劑。
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