摘要：本文詳解PolysciencesPEI轉染試劑在293T、Expi293F、CHO-S細胞中的優(yōu)化方案，解決瞬轉效率低、表達弱、產量低問題，提供標準化流程與問題排查。

關鍵詞：PolysciencesPEI,PEI轉染試劑,23966,24765,瞬時轉染,轉染效率,蛋白表達,抗體生產,HEK293T,Expi293F,CHO-S,轉染優(yōu)化指南

產品范圍：Polysciences 25 kDa線性PEI（貨號：23966系列）、PEIMAX（40kDa）（貨號：24765系列）

適用場景：HEK293T、Expi293F、CHO-S細胞重組蛋白/單克隆抗體瞬時轉染表達

PEI轉染體系有哪些環(huán)節(jié)可優(yōu)化？

聚乙烯亞胺（PEI）作為經(jīng)典陽離子聚合物轉染試劑，憑借成本可控、操作簡便、易于放大等優(yōu)勢，已成為全球數(shù)千家實驗室和生物制藥企業(yè)進行重組蛋白/抗體瞬轉的常用工具。然而，在實際應用中，用戶常遇到轉染效率低、蛋白表達弱、抗體產量上不去等問題。這些問題通常不是單一因素導致的，而是細胞狀態(tài)、核酸質量、轉染參數(shù)、培養(yǎng)條件等多因素協(xié)同作用的結果。

本文針對293T、Expi293F、CHO-S三種主流表達細胞系，基于Polysciences全球數(shù)千家用戶的驗證數(shù)據(jù)，系統(tǒng)梳理PEI轉染體系的關鍵優(yōu)化節(jié)點，提供可直接落地的標準化操作方案，并附上文獻和工業(yè)界應用案例供參考。

一、核心影響因素及針對性優(yōu)化方案

1.細胞狀態(tài)優(yōu)化（關鍵因素，占成功率的60%以上）

細胞質量是決定轉染效率和后續(xù)蛋白表達的基礎，任何轉染試劑都無法彌補狀態(tài)不佳的細胞帶來的損失。

關鍵提示：

• 建議建立三級細胞種子庫（主種子-工作種子-實驗用細胞），每批次實驗使用同一代次的細胞

• 懸浮細胞轉染前18-24小時精準傳代，確保轉染時處于對數(shù)生長中期

• 避免使用剛復蘇或長滿后超過24小時的細胞進行轉染

2.質粒DNA質量與用量優(yōu)化

質粒DNA的純度、內毒素含量和濃度直接影響PEI-DNA復合物的形成和細胞攝取效率。

（1）質量要求

· 純度：A260/A280=1.8-1.9，A260/A230>2.0

· 內毒素含量：<1EU/μg（瞬轉實驗標準，使用去內毒素質粒提取試劑盒即可滿足）

· 無污染物：無RNA、蛋白、酚、鹽離子殘留

· 濃度：500-1000ng/μL（濃度過低會導致稀釋體積過大，影響復合物均一性）

（2）用量優(yōu)化（按1×10?細胞計算）

關鍵提示：

· 多質粒共轉染時，總DNA量保持不變，各質粒比例根據(jù)表達需求調整

· 抗體表達時，重鏈(HC):輕鏈(LC)質粒比例常用1:1、1:1.5、3:2，需根據(jù)具體抗體序列優(yōu)化

· 避免使用過量DNA，否則會導致細胞毒性增加，反而降低蛋白產量

3.DNA:PEI比例（N/P比）優(yōu)化

N/P比（PEI中氮原子與DNA中磷原子的摩爾比）是PEI轉染體系中較核心的參數(shù)，直接決定復合物的凈電荷、粒徑大小、細胞攝取效率和細胞毒性。

優(yōu)化方法：

· 采用矩陣法進行系統(tǒng)優(yōu)化：固定DNA用量，測試PEI:DNA質量比從1:2到1:4的梯度

· 同時檢測轉染效率（如GFP陽性率）和細胞活力（轉染后24-48小時）

· 選擇轉染效率高且細胞活力>80%的比例作為較優(yōu)比例

關鍵提示：

· 不同批次的PEI工作液可能存在細微差異，建議每批次重新驗證較優(yōu)比例

· PEI MAX 40kDa的較優(yōu)比例通常比25kDa線性PEI略低（約1:2.5-1:3）

4.轉染復合物制備優(yōu)化（操作細節(jié)決定成?。?/strong>

復合物的制備方法直接影響其粒徑分布和均一性，進而影響轉染效率和重復性

（1）稀釋液選擇

· 推薦：Opti-MEM、無血清培養(yǎng)基，或PBS緩沖液、150mM NaCl溶液等作為稀釋液

· 替代：無血清DMEM/F12培養(yǎng)基（不含抗生素、水解物）

· 避免：含有血清、抗生素、硫酸葡聚糖、高濃度磷酸鹽或水解物的培養(yǎng)基（這些成分會與PEI競爭結合DNA，或導致復合物聚集，轉染效率可下降50%以上）

（2）制備步驟（關鍵！順序不能顛倒）

1. 將DNA和PEI分別用稀釋液稀釋至相同體積

2. 將稀釋后的PEI溶液緩慢滴加到稀釋后的DNA溶液中（勿顛倒順序）

3. 輕輕渦旋5秒或用移液器吹打3-5次混勻

4. 室溫孵育10-15分鐘（共孵育時間不可超過20分鐘，否則復合物會明顯聚集變大）

5. 孵育完成后立即均勻加入細胞培養(yǎng)物中

（3）孵育體積

· 復合物孵育體積應為總培養(yǎng)體積的5%-10%

· 體積過小會導致局部濃度過高，復合物聚集；體積過大則復合效率下降

5.轉染后培養(yǎng)條件優(yōu)化

轉染后的培養(yǎng)條件直接影響細胞的存活和蛋白的持續(xù)表達。

（1）溫度優(yōu)化

· 常規(guī)培養(yǎng)：37℃，5%CO?，飽和濕度

· CHO-S細胞抗體表達：轉染后24小時將溫度降至31℃，可顯著提高抗體產量（提升幅度30%-100%）

· 低溫培養(yǎng)可降低細胞代謝速率，延長細胞存活時間，增加蛋白積累

（2）換液策略

· 293T貼壁細胞：通常情況下，將細胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)18~24小時后，更換含有正常濃度血清的培養(yǎng)基。

    ·如細胞可耐受無血清/低血清培養(yǎng)，也可無需更換培養(yǎng)基，PEI-DNA復合物不會對細胞造成毒性。

    ·如細胞在無血清/低血清條件下培養(yǎng)耐受較差，可在轉染后4小時后更換含有正常血清的培養(yǎng)基。

· Expi293F懸浮細胞：如轉染后24小時補加10%-20%體積的新鮮培養(yǎng)基或專用補料

· CHO-S懸浮細胞：如轉染后不換液，轉染后24小時和48小時分別補加專用補料

（3）收獲時間優(yōu)化

關鍵提示：

· 收獲時間過早，蛋白表達未達到峰值；收獲過晚，蛋白會被細胞分泌的蛋白酶降解；

· 建議進行時間梯度實驗（每24小時取樣一次），確定具體蛋白/抗體的較佳收獲時間。

二、分細胞系標準優(yōu)化流程

1.HEK293T貼壁細胞蛋白/抗體瞬轉優(yōu)化流程

1. 轉染前1天：按每孔2×10?細胞的密度接種到6孔板中，37℃，5%CO?培養(yǎng)

2. 轉染當天：細胞匯合度達到70-80%，更換為2mL含低血清培養(yǎng)基（＜5%）

3. 復合物制備：

· A管：1μg質粒DNA+100μLOpti-MEM，輕輕混勻

· B管：3μL1mg/mLPEI+100μLOpti-MEM，輕輕混勻

· 將B管緩慢加入A管，輕輕渦旋5秒，室溫孵育15分鐘

4. 將復合物逐滴加入細胞孔中，輕輕晃動培養(yǎng)板使其均勻分布

5. 轉染后18-24小時：更換為2mL新鮮培養(yǎng)基（含10%FBS）

· 如細胞可耐受無血清/低血清培養(yǎng)，也可無需更換培養(yǎng)基，PEI-DNA復合物不會對細胞造成毒性。

· 如細胞在無血清/低血清條件下培養(yǎng)耐受較差，可在轉染后4小時后更換含有正常血清的培養(yǎng)基。

· 通常，在轉染后24-48小時即可檢測到表達的抗體/重組蛋白，轉染后72-96小時可觀察到較大產量，建議優(yōu)化收樣時間以較大化產量。

2.Expi293F懸浮細胞抗體瞬轉優(yōu)化流程（100mL搖瓶規(guī)模）

1. 轉染前1天：按0.8×10?cells/mL的密度接種細胞，37℃，120rpm，5%CO?培養(yǎng)

2. 轉染當天：細胞密度達到1.8-2.2×10?cells/mL，活力≥98%

3. 復合物制備：

· A管：150μg質粒DNA（重鏈：輕鏈=1:1）+5mL Opti-MEM，輕輕混勻

· B管：450μL1mg/mL PEIMAX + 5mL Opti-MEM，輕輕混勻

· 將B管緩慢加入A管，輕輕渦旋5秒，室溫孵育15分鐘

4. 將復合物逐滴加入細胞培養(yǎng)物中，輕輕搖晃搖瓶混勻

5. 轉染后24小時：補加10mL Expi293表達培養(yǎng)基和1mL ExpiFectamine293轉染補料

6. 轉染后96-120小時：收集上清，純化抗體

3.CHO-S懸浮細胞抗體瞬轉優(yōu)化流程（100mL搖瓶規(guī)模）

1. 轉染前1天：按1.0×10?cells/mL的密度接種細胞，37℃，120rpm，5%CO?培養(yǎng)

2. 轉染當天：細胞密度達到2.5-3.0×10?cells/mL，活力≥95%

3. 復合物制備：

· A管：200μg質粒DNA（重鏈：輕鏈=2:3）+ 5 mL Opti-MEM，輕輕混勻

· B管：500μL 1mg/mL PEIMAX + 5mL Opti-MEM，輕輕混勻

· 將B管緩慢加入A管，輕輕渦旋5秒，室溫孵育15分鐘

4. 將復合物逐滴加入細胞培養(yǎng)物中，輕輕搖晃搖瓶混勻

5. 轉染后24小時：將溫度降至31℃，補加10mLCHO表達培養(yǎng)基和0.25%DMA

6. 轉染后48小時：再次補加10mL CHO表達培養(yǎng)基

7. 轉染后120-168小時：收集上清，純化抗體

三、常見問題排查表

四、參考文獻與應用案例

· Stuible M, Burlacu A, Perret S, et al. Optimization of a high-cell-density polyethylenimine transfection method for rapid protein production in CHO-EBNA1 cells[J]. Journal of Biotechnology, 2018, 280: 33-41. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2018.06.307

· Overcoming the media design challenges in transient gene expression with CHO cell lines

· Porte M, Stock F, Horry H. Robust and reliable transient protein production with PEIpro®, a well characterized polyethylenimine optimized for transfection[J/OL]. GEN (Genetic Engineering & Biotechnology News), 2012, 32(5). 2012-03-01.

· Construction of a system for rapid evaluation of production enhancer gene in CHO antibody production

五、技術支持

上海曼博生物醫(yī)藥科技有限公司是KyforaBio by Polysciences中國直售商，提供全系列PEI轉染試劑及專業(yè)技術支持，如果您在使用PolysciencesPEI轉染試劑過程中遇到任何問題，請聯(lián)系曼博生物的技術支持團隊，曼博將為您提供一對一的技術指導，幫助您解決轉染和表達過程中遇到的各種問題。也可掃描下方圖片訪問曼博生物網(wǎng)站查看具體產品信息：

本文基于Polysciences公開資料由其中國提供商上海曼博生物整理，僅用于科研信息分享。上海曼博生物可提供Polysciences PEI轉染試劑、PEIMAX、25kDa線性PEI、HEK293T瞬時轉染、Expi293F抗體表達、CHO-S蛋白表達等相關產品與技術支持服務，助力重組蛋白、抗體及病毒載體研發(fā)與生產。