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英國Nuclera公司的eProtein Discovery是一個無細胞蛋白質(zhì)合成（CFPS）系統(tǒng)，也被稱作體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)，能夠?qū)崿F(xiàn)蛋白質(zhì)的快速原型設(shè)計。該系統(tǒng)采用數(shù)字微流控芯片和定制試劑，可針對多達192種條件篩選蛋白質(zhì)表達與可溶性，包括在8種無細胞表達條件下對至多24種構(gòu)建體的篩選?？稍?8小時內(nèi)完成從DNA到蛋白質(zhì)篩選與放大生產(chǎn)。
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B 淋巴細胞抗原CD19是一種跨膜糖蛋白，為B細胞惡性腫瘤生物標志物、CAR - T等療法理想靶點，包含單個跨膜螺旋（292-313）、天然信號肽（1-20）、胞外N端結(jié)構(gòu)域（ECD）和胞內(nèi)C端結(jié)構(gòu)域（ICD）。其ECD有兩個通過二硫鍵連接的免疫球蛋白樣C2型結(jié)構(gòu)域，ICD有多個無序區(qū)域。生產(chǎn)CD19，尤其是ECD對開發(fā)新的B細胞淋巴瘤治療方法十分重要。然而，ECD素來有“難表達"的特點，會導(dǎo)致表達滴度低、蛋白質(zhì)錯誤折疊和聚集，阻礙了對細胞表面分子的詳細分子研究。
在本應(yīng)用中，我們利用eProtein Discovery系統(tǒng)的可溶性標簽選擇功能和無細胞混合物，在24小時內(nèi)篩選了192種表達條件，優(yōu)化了可溶性CD19蛋白的生產(chǎn)（如圖1所示）。我們成功表達并純化了全長CD19、ECD和ICD。篩選完成后，在24小時內(nèi)將適合條件進行放大，可生產(chǎn)微克級的蛋白質(zhì)，從而實現(xiàn)了治療研究所需復(fù)雜蛋白質(zhì)的提效生產(chǎn)。本應(yīng)用為表達其他具有跨膜結(jié)構(gòu)域、二硫鍵和高度無序區(qū)域的“難表達"蛋白質(zhì)提供了參考。
eProtein Discovery系統(tǒng)利用無細胞蛋白質(zhì)合成技術(shù)，可快速篩選蛋白質(zhì)構(gòu)建體并放大生產(chǎn)復(fù)雜蛋白質(zhì)（圖1）。
圖1. eProtein Discovery工作流程。從DNA到可溶性蛋白只需48小時。
在本研究中，選擇了三種CD19長度變體：全長CD19（CD19_21-556）、N端截短體（CD19_21-277）和C端截短體（CD19_327-556）。這兩種截短體均去除了CD19的跨膜區(qū)域。此外，全長和N端截短體均省略了初始信號肽序列（0-20）。這些變體被輸入eProtein Discovery軟件并進行密碼子優(yōu)化，隨后添加3C和TEV側(cè)翼序列。使用可溶性篩選構(gòu)建體試劑盒生成包含不同可溶性標簽的表達構(gòu)建體，以及一個不含可溶性標簽的構(gòu)建體。每個構(gòu)建體的C端均整合了用于磁珠純化的Strep標簽和用于表達純化后蛋白質(zhì)定量的檢測標簽（圖2A）。
圖2. 實驗篩選條件。（A）為三種CD19長度變體生成的帶有可溶性標簽的 eGene 構(gòu)建體。
在制備eGene構(gòu)建體后，向8種包含無細胞核心試劑的無細胞混合物中添加各種添加劑，包括分子伴侶（DnaK）、二硫鍵促進劑（PDI+/GSSG）和可溶性標簽切割酶（3C蛋白酶）（圖2B）。
圖2. 實驗篩選條件。（B）用于提高可溶性蛋白產(chǎn)量的無細胞混合物選擇。
將24種eGene構(gòu)建體和8種無細胞混合物與純化磁珠、對照/空白樣品和緩沖液一起加樣到卡盒上。這種利用eProtein Discovery系統(tǒng)的設(shè)置，促進了192種表達譜的自動生成和分析。每種CD19變體表達最高的10種eGene/無細胞混合物組合會被自動選擇用于純化，并完成蛋白質(zhì)檢測以確定預(yù)測的放大產(chǎn)量，所有這些都在24小時內(nèi)完成。
對于每種CD19變體，將預(yù)測產(chǎn)量至高的表達方案第二天進行放大生產(chǎn)，并使用放大試劑盒進行純化，以生產(chǎn)微克級的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)純度和產(chǎn)量通過SDS-PAGE和熒光測定法進行定量分析。
eProtein Discovery系統(tǒng)成功表達并純化了全長CD19蛋白及其截短變體，證明了其*的性能（見圖 3）。該系統(tǒng)用于快速篩選192種表達條件，并在24小時內(nèi)獲得30個可純化性數(shù)據(jù)點，以確定生產(chǎn)可溶性CD19蛋白變體的最佳條件（圖 3A 和 3B）。
圖3. 篩選結(jié)果。（A）每種eGene構(gòu)建體與無細胞混合物組合的表達產(chǎn)量。
圖3. 篩選結(jié)果。（B）每種CD19長度變體表達量至高的 10 種組合經(jīng)純化后確定純化濃度。
在三種CD19變體中，N端胞外結(jié)構(gòu)域（CD19_21-277）的蛋白產(chǎn)量更高，預(yù)測產(chǎn)量達29.68 μg/200 μL（圖 3C）。
圖3. 篩選結(jié)果。（C）200μL放大體系的預(yù)測產(chǎn)量。
引入可溶性標簽（尤其FH8標簽）使CD19總產(chǎn)量顯著提升32% ；無細胞混合物中添加PDI+/GSSG可促進二硫鍵形成，提升ECD表達量，混合物4與FH8標簽聯(lián)用預(yù)測產(chǎn)量更高，混合物3則兼具高產(chǎn)量與標簽切除靈活性。該系統(tǒng)成功篩選出生產(chǎn)可溶性全長CD19的條件，產(chǎn)量4.29 μg/200 μL，混合物3表現(xiàn)優(yōu)，體現(xiàn)優(yōu)化蛋白生產(chǎn)的多功能性與精準性，不過全長CD19產(chǎn)量仍需優(yōu)化。無細胞系統(tǒng)有效降低了天然系統(tǒng)中無序蛋白常見的蛋白酶降解風險，同時通過可溶性標簽和添加劑的使用減少不溶性聚集物的產(chǎn)生。這一能力使得該挑戰(zhàn)性蛋白得以成功表達和純化。
在篩選192種表達條件并純化30種以確定預(yù)測產(chǎn)量后，每種CD19變體的合適條件被放大，在24小時內(nèi)生產(chǎn)出微克級蛋白用于下游應(yīng)用。SDS-PAGE分析證實所有CD19變體均成功表達，其中N端ECD純度達88%，C端胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域純度達100%，但全長蛋白純度較低（圖4A）。通過內(nèi)部熒光測定和SDS-PAGE進行的蛋白產(chǎn)量定量與預(yù)測產(chǎn)量高度吻合，證明了該系統(tǒng)從篩選到放大的可靠性（圖4B）?？傮w結(jié)果證實了eProtein Discovery系統(tǒng)在明顯加速高質(zhì)量復(fù)雜蛋白生產(chǎn)方面的有效性和精確性。
圖4. CD19放大生產(chǎn)結(jié)果。（A）使用優(yōu)化后的eGene/無細胞混合物在200 µL體系中表達并純化的CD19長度變體的SDS-PAGE分析（FT=流出液）。
圖4. CD19放大生產(chǎn)結(jié)果。（B）通過內(nèi)部熒光測定和SDS-PAGE確定的蛋白產(chǎn)量與系統(tǒng)預(yù)測產(chǎn)量的對比。
通過同步測試不同CD19蛋白構(gòu)建序列、可溶性標簽及蛋白表達參數(shù)，eProtein Discovery可在24小時內(nèi)快速確定合適的蛋白表達條件，并在48小時內(nèi)獲得目標蛋白。這一能力使研究人員能夠快速開展蛋白靶點鑒定及疾病機制相關(guān)蛋白的驗證工作。該系統(tǒng)整合數(shù)字微流控技術(shù)、蛋白質(zhì)質(zhì)量分析及無細胞蛋白合成技術(shù)，即使對于最難表達的蛋白質(zhì)也能實現(xiàn)快速制備，從而大幅簡化了治療性研究與開發(fā)的流程。
KEY英國Nuclera公司由劍橋大學(xué)的博士生們于2013年創(chuàng)立。在撰寫論文期間，他們發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)難以獲取的問題是生物學(xué)領(lǐng)域的重要障礙和瓶頸。他們著手解決蛋白質(zhì)難以獲取的問題，以期改善人類健康狀況。公司的愿景是打造出從DNA到蛋白質(zhì)的原型設(shè)計系統(tǒng)，以減少在藥物發(fā)現(xiàn)計劃中獲得靶蛋白的時間和障礙。
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