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本文來(lái)源于微信公眾號(hào)：Of studies 作者：Of studies
嵌合抗原受體工程化 T 細(xì)胞（CAR-T）治療是一種有效的癌癥免疫療法。CAR-T 細(xì)胞可被重新定向，特異性識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原（TAA），并誘導(dǎo)較強(qiáng)的抗腫瘤活性。然而，由于 TAA 在健康組織中存在低水平表達(dá)，它們也可能引發(fā)“靶向腫瘤但脫靶正常組織（on target off tumor）"的毒性。這些不良反應(yīng)已引起重要安全問(wèn)題，并限制了這一具有潛力的治療方式的臨床應(yīng)用。遮蔽肽或可為免疫治療提供新的研發(fā)方向。
學(xué)習(xí)一篇較早的、2017 年發(fā)表在 Molecular Therapy 的文章，研究者為 CAR-T 設(shè)計(jì)了一種“面具"，即針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）的遮蔽型 CAR（masked CAR），其由一段遮蔽肽（可阻斷抗原結(jié)合位點(diǎn)）和一個(gè)蛋白酶敏感連接肽組成。腫瘤微環(huán)境中常見(jiàn)的蛋白酶可切割該連接肽，使遮蔽肽脫落，從而讓 CAR-T 細(xì)胞主要在腫瘤部位識(shí)別靶抗原。體外實(shí)驗(yàn)顯示，在沒(méi)有蛋白酶的情況下，masked CAR 的抗原結(jié)合能力和抗原特異性激活明顯降低；而在加入特定蛋白酶后，其結(jié)合與活性可恢復(fù)至接近正常水平。遮蔽型 CAR-T 細(xì)胞在體內(nèi)的抗腫瘤效果與未遮蔽 CAR 相近。
主要結(jié)果
1.EGFR CAR-T 的設(shè)計(jì)
編碼 masked 遮蔽肽序列：QGQSGQCISPRGCPDGPYVMY（源自 Cetuximab probody 的抗原結(jié)合位點(diǎn)封閉肽）；
蛋白酶敏感 linker（可切割）序列：GSSGGSGGSGGSG-LSGRSDNH-GSSGT；蛋白酶底物序列 LSGRSDNH 是 uPA/matriptase/legumain（在腫瘤微環(huán)境顯著上調(diào)的蛋白水解酶）的底物核心，兩側(cè)用 GS-rich 柔性鏈隔開(kāi)。
非切割對(duì)照 linker（NSUB）序列：GSSGGSGGSGGSG-GGSGGGSG-GSSGT；將酶底物序列 -LSGRSDNH- 替換為同長(zhǎng)度、不可切割的 GS 富集序列（8 個(gè)氨基酸）。
2.CAR 的表達(dá)和遮蔽情況
從人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）中分離出的細(xì)胞經(jīng)活化后，用未遮蔽、遮蔽和 NSUB 抗 EGFR 嵌合抗原受體（CAR）的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，并在體外擴(kuò)增 10 天。通過(guò)蛋白 L 流式檢測(cè) CAR 表面表達(dá)，rhEGFR-Fc 流式檢測(cè)結(jié)合能力。
三組 CAR 表達(dá)率均約為 30–35 %（無(wú)顯著差異）；
結(jié)合率：Unmasked 35 % → Masked 3 % → NSUB 0.4 %；遮蔽后結(jié)合力降至接近背景水平，說(shuō)明遮蔽效果明顯。
3.蛋白酶處
3、蛋白酶處理后不同嵌合抗原受體（CAR）與靶抗原 EGFR 的結(jié)合情況
未遮蔽、遮蔽和 NSUB 抗 EGFR CAR-T 細(xì)胞經(jīng)不同濃度（0 nM、100 nM 和 400 nM）尿激酶型纖溶酶原激活劑（uPA）處理后，用重組人 EGFR-Fc（rhEGFR-Fc）和山羊抗人 Fc 抗體染色，評(píng)估蛋白酶處理對(duì) CAR 與抗原結(jié)合的影
響。
0 nM 時(shí)結(jié)合約為 6 %；100 nM 結(jié)合約 23 %；400 nM 結(jié)合約 29 %（接近未遮蔽組），結(jié)合恢復(fù)呈現(xiàn) uPA 劑量依賴(lài)性，表明 linker 可被切割。
4.不同靶細(xì)胞刺激下的各種 CAR-T 細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)因子染色
在體外激活和擴(kuò)增 10 天后，未遮蔽、遮蔽和 NSUB 型 CAR-T 細(xì)胞分別與 K562、K562-EGFR、MDA-MB-231 或 NCI-H292 細(xì)胞共培養(yǎng) 6 小時(shí)。未受刺激的 CAR-T 細(xì)胞作為陰性對(duì)照，而經(jīng)抗 CD3/CD28 抗體刺激的 CAR-T 細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)染色測(cè)量干擾素 γ（IFN-γ）的產(chǎn)生量。
K562-EGFR 穩(wěn)定株高表達(dá) EGFR，但幾乎不分泌 uPA；MDA-MB-231 和 NCI-H292 則高分泌 uPA。
A圖為一個(gè)donor的代表性流式結(jié)果，B為3個(gè)donor定量數(shù)據(jù)。
結(jié)果顯示：Unmasked 對(duì)任何 EGFR? 細(xì)胞均引起 15–20 % IFN-γ?；
Masked 對(duì) K562-EGFR（無(wú)蛋白酶環(huán)境）僅約 0.9 %（處于關(guān)閉狀態(tài)）；對(duì) MDA231/H292（分泌蛋白酶環(huán)境）則升至 16–17 %（遮蔽型 CAR-T 的 linker 被裂解，恢復(fù) EGFR 結(jié)合）；NSUB 始終低于 7 %；
證明蛋白酶存在時(shí)可移除遮蔽，“激活" T 細(xì)胞功能。
5.不同 CAR-T 細(xì)胞對(duì)不同靶細(xì)胞系的體外細(xì)胞毒性作用
CFSE 標(biāo)記靶細(xì)胞 → 與 CAR-T 按 1:1–10:1 比例共孵育 → 7-AAD 流式檢測(cè)存活率。
未遮蔽組對(duì) K562-EGFR、231、H292 細(xì)胞的殺傷作用均較明顯；
遮蔽組幾乎不殺傷 K562-EGFR（E:T=10 時(shí)僅約 20 % 殺傷），但對(duì) 231 和 H292 的殺傷可恢復(fù)至未遮蔽組水平；
NSUB 組的殺傷活性始終較低；
體內(nèi)外功能一致表明：腫瘤蛋白酶可作為殺傷活性的調(diào)控開(kāi)關(guān)。
（A）CAR-T 細(xì)胞以 1:1、3:1 或 10:1 的效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比例與 K562-EGFR 細(xì)胞共培養(yǎng) 4 小時(shí)，然后測(cè)量對(duì) K562-EGFR 細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
（B）CAR-T 細(xì)胞以 1：1、3：1 或 10：1 的效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比例與 NCI-H292 細(xì)胞共培養(yǎng) 18 小時(shí)，并測(cè)量細(xì)胞毒性。
（C）CAR-T 細(xì)胞以 1：1、2.5：1、5：1 或 10：1 的效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比例與 MDA-MB-231 細(xì)胞共培養(yǎng) 18 小時(shí)，并測(cè)量細(xì)胞毒性
6.CAR-T 細(xì)胞在人類(lèi)肺癌異種移植模型中的抗腫瘤效果
NSG 小鼠右脅皮下接種 NCI-H292 肺癌細(xì)胞，12 天后腫瘤體積約 120 mm3 → 隨機(jī)分為 4 組（n=8），第 13、26 天尾靜脈輸注 4×10? CAR-T 細(xì)胞。
未遮蔽組與遮蔽組腫瘤生長(zhǎng)均受到顯著抑制（p<0.05），兩組曲線接近；NSUB 組與對(duì)照組無(wú)差異；未遮蔽組中位生存期 50.5 天，遮蔽組 49 天；對(duì)照組/NSUB 組為 42 天（p<0.01）。遮蔽設(shè)計(jì)未明顯減弱體內(nèi)抗腫瘤效果，且可能提升安全性（未觀察到體重下降、皮膚或腸道毒性）。
附：Cetuximab probody 簡(jiǎn)介
Cetuximab probody 是 2013 年 AbbVie 在 Science Translational Medicine 報(bào)道的“前體抗體"版本 cetuximab，可理解為在原抗體上加了一個(gè)可移除的“遮蓋肽"，使其在健康組織中保持靜默，到達(dá)腫瘤后才被激活。結(jié)構(gòu)上，重鏈 N 端融合了一段 12-14 aa 的“遮蔽肽"，遮蔽肽與重鏈之間插入一條腫瘤相關(guān)蛋白酶（uPA、matriptase 等）可切割的 linker。作用機(jī)制為：循環(huán)中，遮蔽肽折疊并遮擋 Fab 的 CDR 區(qū)，使 EGFR 結(jié)合力下降數(shù)十至數(shù)百倍，F(xiàn)c 功能也受到抑制，幾乎不與正常組織 EGFR 結(jié)合；腫瘤微環(huán)境中，高濃度 uPA/matriptase 切割 linker → 遮蔽肽脫落 → 抗體功能恢復(fù)至母本 cetuximab 水平 → 正常阻斷 EGFR 信號(hào)并介導(dǎo) ADCC/CDC。
小結(jié)
Masked CAR 在正常組織中保持靜默，在腫瘤部位經(jīng)蛋白酶作用移除遮蔽后可充分恢復(fù)結(jié)合、激活與殺傷活性，在保持相近療效的同時(shí)，有助于降低正常組織中 on-target off-tumor 的潛在風(fēng)險(xiǎn)。這項(xiàng)早期研究驗(yàn)證了提升傳統(tǒng) CAR 安全性的可行思路，或可為今后設(shè)計(jì)靶向廣泛表達(dá) TAA 的 CAR 分子提供參考。
