一、產(chǎn)品概述

由艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔源抗USP7（泛素特異性蛋白酶7，又稱HAUSP）多克隆抗體（貨號(hào)：A300-033A），經(jīng)抗原親和純化，特異性識(shí)別人類和小鼠USP7蛋白。抗體適用于免疫組織化學(xué)（IHC）、免疫沉淀（IP）和免疫印跡（WB）。以未偶聯(lián)（Unconjugated）的全I(xiàn)gG形式提供，濃度高達(dá)1000 µg/ml。產(chǎn)品保存于2–8°C，有效期自收貨之日起為1年，原產(chǎn)于美國，適用于去泛素化機(jī)制、p53信號(hào)通路及腫瘤生物學(xué)研究。

二、核心技術(shù)規(guī)格

參數(shù)項(xiàng) | 具體規(guī)格

靶標(biāo) | USP7（泛素特異性蛋白酶7）

反應(yīng)種屬 | 小鼠、人

適用實(shí)驗(yàn) | IHC、IP、WB

宿主 | 兔

克隆性 | 多克隆

抗體形式 | 全I(xiàn)gG

免疫原 | 人USP7蛋白第1至50位氨基酸區(qū)域

同種型 | IgG

偶聯(lián)物 | 未偶聯(lián)

純度 | 抗原親和純化

抗原種屬來源 | 人

濃度 | 1000 µg/ml

儲(chǔ)存溫度 | 2 – 8 °C

有效期 | 1年

緩沖液 | Tris-檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液，pH 7–8，含0.09%疊d化鈉

表位信息：抗體識(shí)別的表位定位于人USP7蛋白的N端第1至50位氨基酸之間（參考序列NP_003461.1，GeneID 7874）。該區(qū)域靠近USP7的TRAF樣結(jié)構(gòu)域（參與與底物如p53、MDM2的相互作用），N端特異性確保抗體能夠識(shí)別全長USP7而不受C端修飾影響。

三、產(chǎn)品制備與質(zhì)量控制

3.1 純化工藝

抗體采用抗原親和純化：將對(duì)應(yīng)人USP7蛋白N端1–50位氨基酸的合成多肽共價(jià)固定于固相支持物上，使兔免疫血清過柱，特異性IgG被吸附；經(jīng)充分洗滌去除未結(jié)合蛋白后，以低pH緩沖液洗脫目標(biāo)抗體，隨后中和、透析并置換至含防腐劑的緩沖液中。

3.2 濃度測(cè)定

免疫球蛋白濃度通過比爾-朗伯定律確定：1 mg/ml純化IgG在280 nm波長處的吸光度（A280）為1.4。本產(chǎn)品批次實(shí)測(cè)A280值經(jīng)換算確保濃度為1000 µg/ml，批間一致性高。

3.3 純度與特異性驗(yàn)證

抗原親和純化工藝可有效去除兔血清中的非特異性IgG及其他血清蛋白。經(jīng)SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色評(píng)估，抗體純度典型值≥95%。功能性特異性通過以下方式驗(yàn)證：

在USP7敲除細(xì)胞裂解物中WB檢測(cè)無信號(hào)

過表達(dá)USP7的細(xì)胞中信號(hào)顯著增強(qiáng)

免疫沉淀后質(zhì)譜鑒定確認(rèn)僅富集USP7及其已知底物（如p53、MDM2）

四、推薦應(yīng)用與稀釋方案

以下用量和稀釋范圍為推薦起始值。由于不同實(shí)驗(yàn)體系存在差異，用戶需根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化。

4.1 免疫印跡（Western Blot，WB）

推薦稀釋范圍：1:10,000 – 1:25,000

封閉與抗體稀釋液：含5%脫脂奶粉的TBST（Tris緩沖鹽+0.1% Tween-20）

一抗孵育條件：4°C 過夜（推薦）

推薦二抗：山羊抗兔IgG（重鏈+輕鏈）抗體，貨號(hào)A120-101P

特殊注意事項(xiàng)：當(dāng)對(duì)免疫沉淀產(chǎn)物進(jìn)行WB檢測(cè)時(shí)，建議使用抗兔IgG輕鏈HRP偶聯(lián)抗體（輕鏈特異性），并在封閉緩沖液中加入5%正常豬血清（貨號(hào)S100-020），以避免重鏈交叉反應(yīng)干擾。

陽性對(duì)照：HeLa、HEK293T、MCF7或小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）全細(xì)胞裂解液。USP7在多種細(xì)胞系中普遍表達(dá)，分子量約為135 kDa。

操作提示：USP7分子量約135 kDa，建議使用8–10% SDS-PAGE凝膠。轉(zhuǎn)膜推薦使用0.45 µm PVDF膜，濕轉(zhuǎn)法（100 V，1.5小時(shí)或4°C過夜）。由于USP7表達(dá)水平較高，通常30–50 μg總蛋白上樣量即可獲得清晰信號(hào)。

4.2 免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）

推薦用量：6 µg 抗體 / mg 細(xì)胞裂解液總蛋白

裂解液選擇：推薦使用溫和非變性裂解液（如含150 mM NaCl、0.5% NP-40、50 mM Tris-HCl pH 7.4、蛋白酶抑制劑混合物）。USP7與底物（如p53、MDM2）的相互作用依賴于非變性條件，避免使用SDS等強(qiáng)變性劑。

孵育條件：裂解液與抗體4°C旋轉(zhuǎn)孵育2–4小時(shí)或過夜，隨后加入Protein A瓊脂糖珠繼續(xù)孵育1–2小時(shí)。

洗脫：可采用SDS-PAGE上樣緩沖液煮沸5分鐘洗脫，或使用低pH甘氨酸緩沖液進(jìn)行非變性洗脫以保留復(fù)合物功能。

陰性對(duì)照：使用同種型兔IgG（非免疫IgG）進(jìn)行平行沉淀，以評(píng)估非特異性背景。

注意：USP7常與MDM2和p53形成三元復(fù)合物，免疫沉淀可同時(shí)檢測(cè)這些相互作用蛋白。推薦使用輕柔洗滌（如裂解液洗滌3次），維持復(fù)合物穩(wěn)定性。

4.3 免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry，IHC）

推薦稀釋范圍：1:1,000 – 1:5,000

抗原修復(fù)：推薦使用檸檬酸鹽緩沖液（10 mM，pH 6.0）進(jìn)行熱誘導(dǎo)抗原修復(fù)（微波或高壓）

樣本類型：福爾馬林固定、石蠟包埋（FFPE）組織切片

檢測(cè)系統(tǒng)：推薦使用聚合物標(biāo)記的HRP二抗系統(tǒng)

陽性對(duì)照組織：人乳腺癌組織、結(jié)腸癌組織或小鼠肝組織。USP7在多數(shù)腫瘤細(xì)胞核和胞漿中呈陽性。

IHC操作提示：USP7定位于細(xì)胞核（為主）和細(xì)胞漿，染色模式因細(xì)胞類型和狀態(tài)而異。建議在封閉步驟中使用5%正常山羊血清阻斷非特異性結(jié)合。一抗4°C孵育過夜可獲得最佳信噪比。