一、研究背景

DNA損傷是細(xì)胞在環(huán)境因素（如紫外線、化學(xué)誘變劑）及自身正常代謝過程（如氧化呼吸鏈產(chǎn)生的活性氧）共同作用下持續(xù)發(fā)生的分子事件。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每個細(xì)胞每天約發(fā)生1000至100萬次DNA損傷事件。盡管這一數(shù)字相對于人類基因組約60億個堿基的總量而言占比甚微，但若關(guān)鍵基因上的損傷未能被及時修復(fù)，將阻礙細(xì)胞正常功能，并顯著增加癌變風(fēng)險(xiǎn)。

Sestili和Cantoni（參考文獻(xiàn)1）開發(fā)了一種新型單細(xì)胞水平DNA損傷檢測技術(shù)——堿性暈圈法。該方法基于以下原理：受損DNA片段在滲透壓驅(qū)動下通過瓊脂糖凝膠孔徑發(fā)生徑向擴(kuò)散，且擴(kuò)散距離與DNA片段大小呈反比?！皶炄?一詞形象地描述了損傷DNA從分離的細(xì)胞核中徑向擴(kuò)散后形成的環(huán)形形態(tài)。

與彗星檢測相比，堿性暈圈法具有獨(dú)特優(yōu)勢：它無需使用電泳來分離受損與未受損DNA，而是在裂解后進(jìn)行短暫的堿性低滲緩沖液孵育即可完成。因此，該方法比彗星檢測更簡單、更快速。需要注意的是，彗星檢測在檢測靈敏度方面仍然更高，適用于對低水平DNA損傷的精細(xì)分析。

二、產(chǎn)品特性與應(yīng)用場景

由艾美捷代理Cell Biolabs公司推出的OxiSelect 3孔暈圈檢測專用玻片（貨號：STA-892），是專為堿性暈圈法設(shè)計(jì)的表面處理型玻片。該玻片經(jīng)過特殊的化學(xué)修飾，能夠有效粘附堿性暈圈法中使用的低熔點(diǎn)瓊脂糖，確保在裂解、擴(kuò)散等操作步驟中凝膠層不易脫落或移位，從而提高實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。

該產(chǎn)品具有以下技術(shù)特點(diǎn)：

孔板規(guī)格：3孔設(shè)計(jì)，每塊玻片可同時檢測3個樣本（如不同處理組或濃度梯度）。每套包含5塊玻片，共計(jì)15個檢測孔，與OxiSelect堿性暈圈檢測試劑盒（貨號STA-890）的15次檢測規(guī)格相匹配。

表面處理：玻片經(jīng)過優(yōu)化化學(xué)處理，增強(qiáng)了對低熔點(diǎn)瓊脂糖的粘附力，無需自行對普通載玻片進(jìn)行硅化或包被處理。

兼容性強(qiáng)：既可與OxiSelect堿性暈圈檢測試劑盒中的配套試劑聯(lián)合使用，也支持用戶自備的暈圈法檢測試劑體系。這為已有成熟實(shí)驗(yàn)方案或希望自行優(yōu)化試劑配方的研究人員提供了靈活選擇。

操作便利：玻片直接適配標(biāo)準(zhǔn)水平電泳槽（盡管暈圈法不需要電泳，但玻片尺寸設(shè)計(jì)便于進(jìn)行孵育、洗滌和染色等操作），無需密封邊緣，簡化實(shí)驗(yàn)流程。

典型應(yīng)用場景包括：

化合物遺傳毒性的快速初篩

DNA修復(fù)能力的定性/半定量評估

抗氧化劑的保護(hù)效果評價(jià)

環(huán)境樣本（如空氣顆粒物、水污染物）的致突變性檢測

三、操作流程要點(diǎn)

使用該玻片進(jìn)行堿性暈圈檢測時，推薦流程如下：

1. 包埋細(xì)胞：將待測細(xì)胞懸液與熔融的低熔點(diǎn)瓊脂糖（37℃）混合，迅速滴加至玻片的各孔中，4℃凝固10分鐘。

2. 裂解與擴(kuò)散：加入堿性低滲擴(kuò)散緩沖液（含裂解成分），4℃孵育20-30分鐘。在此過程中，細(xì)胞膜和核膜被破壞，損傷DNA片段在滲透壓驅(qū)動下徑向擴(kuò)散，形成暈圈。

3. 中和與固定：去除擴(kuò)散液，用去離子水或中和緩沖液洗滌，再用70%乙醇固定5分鐘。

4. 染色與觀察：加入DNA熒光染料（如Vista Green），室溫避光染色15分鐘，在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

5. 量化分析：測量每個細(xì)胞核的直徑和暈圈外徑，計(jì)算核擴(kuò)散因子（NDF = 暈圈直徑/核直徑）或暈圈面積/核面積。建議每個樣本至少分析50個細(xì)胞。

用戶若自備試劑，需確保裂解擴(kuò)散液的堿性和低滲條件符合堿性暈圈法的標(biāo)準(zhǔn)要求（通常pH > 12.5）。

四、典型結(jié)果示例

圖1. H2O2處理293細(xì)胞。在進(jìn)行堿性暈圈檢測（STA-890）前，293細(xì)胞未經(jīng)處理（上圖）或經(jīng)1 mM H2O2處理30分鐘（下圖）。

五、注意事項(xiàng)

1. 玻片為一次性使用耗材，不可重復(fù)利用，以免表面化學(xué)處理層失效或孔間交叉污染。

2. 低熔點(diǎn)瓊脂糖與細(xì)胞混合前必須冷卻至37℃左右，溫度過高會導(dǎo)致細(xì)胞熱損傷，過低則瓊脂糖提前凝固，無法均勻包埋。

3. 擴(kuò)散緩沖液應(yīng)新鮮配制并預(yù)冷至4℃，以保證裂解效果和抑制核酸酶活性。

4. 染色后應(yīng)盡快在熒光顯微鏡下觀察和拍照，避免長時間光照導(dǎo)致熒光淬滅。

5. 由于堿性暈圈法的靈敏度低于彗星檢測，對于預(yù)期DNA損傷水平較低或需要精確定量的實(shí)驗(yàn)，建議優(yōu)先考慮彗星檢測方法。

文獻(xiàn)參考：

1. Sestili P., and Cantoni O. (1999) Free Radic. Biol. Med. 26, 1019-1026.

2. Ostling, O., and Johanson, K. J. (1984). Biochem. Biophys. Res. Commun. 123, 291–298.

3. Sestili P., Martinelli C., and Stocchi V.? (2006) Mutat Res 607, 205–214.