葡萄膜炎是一類涉及眼球內(nèi)部多種結(jié)構(gòu)的炎性疾病，具有高發(fā)病率與高致盲風(fēng)險(xiǎn)。由于臨床研究存在技術(shù)限制和倫理約束，建立可靠的動(dòng)物模型成為揭示其病理機(jī)制和開發(fā)治療方法的關(guān)鍵途徑。

目前常用的動(dòng)物模型包括實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）和內(nèi)毒素誘導(dǎo)的葡萄膜炎兩類。鑒于人類葡萄膜炎多與自身免疫反應(yīng)相關(guān)，EAU模型憑借其高度模擬人類自身免疫病理的特征，成為該領(lǐng)域研究的核心模型體系。

EAU是研究自身免疫性葡萄膜炎的“金標(biāo)準(zhǔn)"動(dòng)物模型。該模型能準(zhǔn)確再現(xiàn)人類疾病的關(guān)鍵病理特征，包括淋巴細(xì)胞浸潤、血-視網(wǎng)膜屏障破壞及視網(wǎng)膜組織損傷，為疾病機(jī)制研究、藥物篩選和治療評估提供了不ke或缺的研究平臺。

一、模型原理與機(jī)制

EAU是通過免疫介導(dǎo)的特異性T細(xì)胞反應(yīng)誘發(fā)的自身免疫性疾病模型，其核心機(jī)制為：

抗原致敏 → T細(xì)胞活化 → 血眼屏障突破 → 視網(wǎng)膜攻擊 → 炎癥級聯(lián)反應(yīng)

病理特征模擬：

• 視網(wǎng)膜血管炎、脈絡(luò)膜炎

• 光感受器細(xì)胞破壞

• 視力功能喪失

• 可模擬急性、慢性及復(fù)發(fā)性病程

二、抗原的選擇

EAU模型的建立主要依賴于視網(wǎng)膜特異性抗原的免疫誘導(dǎo)。目前常用的誘導(dǎo)抗原包括視網(wǎng)膜可溶性抗原（S-Ag）、光感受器間維生素A類結(jié)合蛋白（IRBP）、視紫紅質(zhì)及恢復(fù)蛋白等。

盡管該模型可在小鼠、大鼠、兔、豚鼠及靈長類動(dòng)物中成功建立，但使用C57BL/6J小鼠所構(gòu)建的模型與人類自身免疫性葡萄膜炎的臨床病理特征最為接近，因而成為該領(lǐng)域研究中最ju代表性的動(dòng)物模型。

通過方法學(xué)的持續(xù)優(yōu)化，目前已被廣泛采用的經(jīng)典建模方案為：以IRBP抗原片段IRBP_651-670與wan全弗氏佐劑（CFA）乳化后，聯(lián)合百日咳毒素（PTX）對C57BL/6J小鼠進(jìn)行免疫，可穩(wěn)定誘導(dǎo)出具有典型病理特征的EAU模型。

三、標(biāo)準(zhǔn)化造模方案

適用動(dòng)物品系

試劑組分清單

本方案選取zui常用的C57BL/6J小鼠造模，詳細(xì)造模流程如下：

1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：通常選擇6-8周齡C57BL/6J小鼠，20-25g。
2、動(dòng)物適應(yīng)：將動(dòng)物在SPF實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)1周，保持溫度、濕度和光照條件穩(wěn)定，自由飲食。
3、EAU模型建立
（1）PTX 溶液配制：將50μg 百日咳毒素（PTX，abs42024900）粉末溶于 500μL PBS（abs962）中，配制成1μg/μL 濃度的 PTX 溶液。

警告： PTX具有多種生物學(xué)效應(yīng)。避免吸入、攝入以及與皮膚和眼睛接觸。穿戴適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)室服裝，包括實(shí)驗(yàn)服、手套和護(hù)目鏡。處理凍干粉時(shí)應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行，建議佩戴丁腈手套，避免產(chǎn)生粉塵和氣溶膠。使用前，應(yīng)輕柔搖晃，不要進(jìn)行劇烈漩渦振蕩，使懸液混合均勻。實(shí)驗(yàn)后殘留PTX溶液及接觸物品應(yīng)按照生物危險(xiǎn)品規(guī)范處理，避免環(huán)境污染。

（2）IRBP_651-670溶液配制：取 25mg IRBP_651-670多肽（abs45156497）粉末，加入1mL的100% DMSO（abs9185），充分溶解，得到25mg/mL DMSO多肽儲存液。將 4mL 的無菌PBS（abs962）緩慢加入到儲存液中，混合均勻，最終得到5 mL的 5 mg/mL IRBP_651-670多肽PBS工作溶液，將溶液在-80℃冰箱和 37℃水浴鍋中反復(fù)凍融 2-4 次，直至液體澄清且無顆粒。   

（3）抗原乳液制備：按照 1:1 體積比將IRBP_651-670多肽溶液和 FCA 溶液（abs90351）加入兩支5 mL玻璃注射器中，并通過三通連接兩支注射器（需提前將器具滅菌處理，防止雜菌污染破壞毒素和抗原活性），在冰上反復(fù)推注40 min-2h，將抗原乳化至油包水狀態(tài)，IRBP_651-670多肽濃度達(dá)到 2.5 mg/mL。

警告：熱滅活的結(jié)核分枝桿菌刺激先天免疫反應(yīng)，避免吸入、攝入以及與皮膚和眼睛接觸。制備佐劑時(shí)嚴(yán)格避免針刺傷，因?yàn)樗赡軐?dǎo)致肉芽腫或誘發(fā)自身免疫反應(yīng)。

乳化質(zhì)量嚴(yán)格驗(yàn)證

①直觀與離心雙重檢測:合格的乳化液呈均勻白色粘稠狀，將其滴入水面后應(yīng)不擴(kuò)散，這是判斷油包水狀態(tài)的直觀標(biāo)準(zhǔn)，也可將乳化液轉(zhuǎn)入離心管，以3000r/min離心1分鐘，若無明顯分層則說明乳化wan全。

②微觀粒徑輔助判斷:顯微鏡下觀察乳化液，需保證油包水結(jié)構(gòu)的粒徑<5μm 的占比超90%，粒徑過大或分布不均會導(dǎo)致抗原釋放不均，進(jìn)而造成動(dòng)物個(gè)體間模型癥狀差異大，影響實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。

（4）麻醉小鼠：使用1.25%三溴乙醇溶液（abs90556）按照 0.2 mL/kg 的劑量對小鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉。

（5）EAU造模：首先對麻醉后小鼠剃毛，在小鼠頸背部、兩側(cè)腹肋部和尾根部（避免刺入肌肉層）四點(diǎn)各注射50 μL 乳液（確保注射均勻，避免局部積液），共200μL（總量500 μg）。皮下注射IRBP乳化液后，立即進(jìn)行腹腔注射 1 次PTX，每只小鼠 1μg（10μL）。

（6）對照組處理：對照組小鼠在相同部位皮下注射等體積的10% DMSO PBS溶液，不注射IRBP乳化液和百日咳毒素。

4、動(dòng)物分組及處理

免疫前將小鼠隨機(jī)分為空白對照組、模型組和治療組，免疫后第14天（第14天是組織學(xué)驗(yàn)證的最佳時(shí)間點(diǎn)，臨床評分可更早開始）取小鼠的眼球（和脾臟），進(jìn)行后續(xù)功能試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)流程圖如下：

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖

四、模型評價(jià)與驗(yàn)證體系

1、臨床評分（輔助標(biāo)準(zhǔn)：基于裂隙燈觀察，評分≥1 分即可判定成功）

從造模后第 8 天起，每隔一天使用裂隙燈觀察小鼠的眼前段，眼底照相機(jī)觀察小鼠的眼底。眼前段和眼底的評分標(biāo)準(zhǔn)如表1。

評分：0 個(gè)“+"得 0 分；1-3 個(gè)“+"得 1 分；4-6 個(gè)“+"得 2 分；7-9 個(gè)“+"得 3 分；10-12 個(gè)“+"得 4 分；13-15 個(gè)“+"得 5 分。

表1 EAU小鼠眼前段臨床評分標(biāo)準(zhǔn)^[1-2]

圖2 裂隙燈眼前段代表性圖。a：造模后 0 d，結(jié)膜無充血，角膜透明，房水清。b：造模后 14 d，可見混合充血（++），房水閃輝，角膜仍透明。c：造模后 21 d，混合充血（+），角膜透明，房水清，炎癥明顯減輕。藍(lán)色箭頭示混合充血，黑色箭頭示房水細(xì)胞^[3] 。

圖3 眼底照相機(jī)代表性圖。a：造模后0 d，眼底玻璃體清，視盤清晰，視網(wǎng)膜平伏，血管正常無炎癥。

2、組織病理學(xué)評分（金標(biāo)準(zhǔn)：基于HE染色，評分≥1 分即可判定成功）

取材時(shí)間點(diǎn)：在免疫后第14天，將小鼠處死，取出眼球。

固定方法：對眼球進(jìn)行固定、脫水、包埋、切片(4–6 μm，每只眼至少 3 張切片)，并進(jìn)行HE染色（abs9217）。

評分標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù) Caspis 標(biāo)準(zhǔn)，0–4 分，對病理切片進(jìn)行評分

病理表現(xiàn)：視網(wǎng)膜折疊、炎癥細(xì)胞浸潤、血管炎等。

表2  EAU小鼠視網(wǎng)膜組織學(xué)評分^[1-2]

圖4 造模后0 d，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)界膜完整。b：造模后14 d，玻璃體滲出，視網(wǎng)膜腫脹、皺褶，可見肉芽腫及血管炎癥，內(nèi)界膜脫離。c：造模后21 d，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)紊亂，皺褶明顯，伴血管炎癥。紅色箭頭示玻璃體滲出，黑色箭頭示視網(wǎng)膜皺褶，黃色箭頭示血管炎，綠色箭頭示肉芽腫^[3]。

3、免疫學(xué)驗(yàn)證（輔助/機(jī)制驗(yàn)證）

T細(xì)胞亞群分析（流式細(xì)胞術(shù)）：Th17細(xì)胞比例顯著升高（關(guān)鍵指標(biāo)）、Treg細(xì)胞比例一般無顯著變化

細(xì)胞因子檢測（qPCR + ELISA）：Il17a mRNA、IL-17A（abs552721）、TNF-α（abs520032） 蛋白表達(dá)上調(diào)等

蛋白質(zhì)組學(xué)/信號通路驗(yàn)證（如STING（abs173857）/NF-κB（abs159078）/IL-6（abs148146）通路激活）

4、血-視網(wǎng)膜屏障功能評估（可選）

伊文思藍(lán)滲漏實(shí)驗(yàn)：尾靜脈注射伊文思藍(lán)（abs47002009），觀察視網(wǎng)膜血管滲漏情況。

緊密連接蛋白表達(dá)（Western Blot）：OCCLUDIN（abs154942）、CLAUDIN-5（abs146481）表達(dá)下降提示屏障破壞。

圖 5 棕櫚酸處理、對照溶劑處理 EAU 小鼠以及未免疫小鼠注射伊文思藍(lán)后的視網(wǎng)膜鋪片^[1]

5、影像學(xué)與功能學(xué)驗(yàn)證（可選，用于深入分析）

光學(xué)相干斷層掃描：評估視網(wǎng)膜厚度和結(jié)構(gòu)層次。

眼底熒光血管造影：評估血管滲漏和屏障破壞。

視網(wǎng)膜電圖：評估光感受器功能損傷（建議在免疫后第21-28天進(jìn)行）。

6、綜合判定標(biāo)準(zhǔn)

金標(biāo)準(zhǔn)：組織病理學(xué)評分 ≥1分，且模型組顯著高于對照組。

輔助標(biāo)準(zhǔn)：臨床評分 ≥1分 + 免疫學(xué)驗(yàn)證（如Th17比例升高）。

可選標(biāo)準(zhǔn)：血-視網(wǎng)膜屏障破壞、影像學(xué)異常、功能學(xué)損傷等。

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）模型以其高仿生性與可重復(fù)性，已成為眼科自身免疫性疾病研究的基石。它不僅是一個(gè)科研工具，更是連接基礎(chǔ)機(jī)制與臨床治療的關(guān)鍵橋梁。通過我們提供的標(biāo)準(zhǔn)化建模方案、系統(tǒng)評價(jià)體系與配套試劑產(chǎn)品，研究人員可高效構(gòu)建穩(wěn)定、可靠的EAU模型，深入探究疾病機(jī)制，加速藥物篩選與治療策略開發(fā)。

我們致力于為科研人員提供全面、可靠的技術(shù)支持與產(chǎn)品服務(wù)，共同推動(dòng)葡萄膜炎及相關(guān)眼病的研究進(jìn)程。如需獲取更多產(chǎn)品信息、技術(shù)資料或?qū)嶒?yàn)支持，歡迎隨時(shí)聯(lián)系我們。

參考文獻(xiàn)：

[1] 馮曉潔.棕櫚酸對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎的作用及機(jī)制研究[D].重慶醫(yī)科大學(xué),2024.
[2] Tian L, Yang P, Lei B, et al. AAV2-mediated subretinal gene transfer of hIFN-α attenuates experimental autoimmune uveoretinitis in mice. PLoS One. 2011;6(5):e19542. doi:10.1371/journal.pone.0019542
[3] 李金清,張秋瑾,鄭柳,等.PKM2/STAT3在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎小鼠中的表達(dá)和作用[J].眼科新進(jìn)展, 2025, 45(12):938-942.

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