線粒體DNA（mtDNA）提取的核心思路是：先分離出完整、純凈的線粒體，再裂解線粒體，從中提取DNA。與核基因組DNA提取不同，mtDNA提取需要更溫和的條件以保持線粒體結構的完整性。

以下是幾種主要的提取方法，從經典實驗室方法到試劑盒方案：

方法一：經典的分步離心法（差速離心 + 密度梯度離心）

這是zui傳統(tǒng)、純度最高的方法，適用于對mtDNA純度要求高的研究（如下一代測序）。

基本流程：

1. 組織或細胞破碎：

• 材料：新鮮或冷凍的組織（如肝臟、肌肉）或大量培養(yǎng)的細胞（如HeLa細胞）。

• 緩沖液：使用 勻漿緩沖液（含蔗糖或甘露醇以維持等滲，防止線粒體膨脹破裂；含EDTA螯合金屬離子；含Tris-HCl維持pH；有時加入BSA保護線粒體膜）。

• 操作：在冰上操作，使用玻璃勻漿器或松緊合適的電動勻漿器溫和破碎細胞，釋放細胞器。

2. 差速離心去除雜質：

• 低速離心（~600 ×g， 4°C， 10分鐘）：去除未破碎的細胞、細胞核、大的膜碎片。上清液包含線粒體、微粒體等。

• 高速離心（~11，000 ×g， 4°C， 10分鐘）：沉淀線粒體。上清液（含核糖體、可溶蛋白等）棄去。

• 洗滌：將線粒體沉淀重懸于勻漿緩沖液，再次高速離心，重復1-2次以去除雜質。

3. 密度梯度離心（進一步提高純度）：

• 將粗提的線粒體沉淀鋪在 Percoll或蔗糖密度梯度液 上。

• 超速離心后，線粒體會在特定密度區(qū)帶（約1.19 g/cm3）富集，而溶酶體、過氧化物酶體等細胞器位于其他區(qū)帶。

• 收集線粒體區(qū)帶，稀釋后離心，得到高純度線粒體。

4. 線粒體裂解與DNA提取：

• 將純化的線粒體沉淀用 線粒體裂解液（含SDS、蛋白酶K）重懸，徹di裂解線粒體膜。

• 后續(xù)采用標準的 酚-氯仿抽提法 或 硅膠柱純化法 去除蛋白質、RNA等雜質，沉淀或洗脫得到mtDNA。

• RNA酶處理是必要步驟，以去除豐富的線粒體RNA。

方法二：試劑盒法（zui常用、最bian捷）

目前大多數實驗室使用試劑盒，它們基于改良的差速離心和柱純化原理，簡化了操作。

操作步驟

準備工作：在DNA 酶I 中加入600uL（50T）或者1100uL（100T）的DNA 酶反應液，適當分裝后-20℃保存。線粒體裂解液保存于常溫，如有沉淀37℃水浴溶解，離心機溫度下降到4℃（2-8℃），如無低溫離心機，也可以常溫離心，并將離心時間為10min 的改為5min，但最后所得DNA 品質及產量可能會有一定影響。

1. 樣本處理

• 組織勻漿：稱取100~200 mg 新鮮組織如肝臟、腦、心肌等，PBS 或生理鹽水沖洗，洗凈血水，濾紙吸干，用剪刀剪為碎塊放入小容量玻璃勻漿器內。加入1.0 mL 冰預冷的細胞裂解液，0℃冰浴上下研磨組織20 次；

• 培養(yǎng)細胞勻漿：消化細胞，PBS 洗滌，800×g 離心5~10 min收集細胞，計數。每次提取需要5×10? 個細胞，加入1.0 mL 冰預冷的細胞裂解液重懸細胞，將細胞懸液轉移到小容量玻璃勻漿器內，0℃冰浴研磨30~40次；

2. 將組織或細胞勻漿物轉移到離心管，4℃，1000×g 離心5 min；

3. 取上清，加入一新的離心管中，4℃，1000×g 再次離心5 min；

4. 取上清，加入一新的離心管中，4℃，12,000 ×g 離心10 min。離心后的上清含胞漿成分，可從中提取胞漿蛋白。將上清轉移到新離心管，線粒體沉淀在管底；

5. 在線粒體沉淀中加入5 mL線粒體清洗液重懸線粒體沉淀，4℃，1000×g 離心5 min；

6. 取上清，加入一新的離心管中，4℃，12,000 ×g 離心10 min。棄上清，高純度的線粒體沉淀在管底；

7. 加入100μL DNA 酶反應液重懸線粒體，吹打均勻后，再加入10μL DNase I 溶液（見準備工作），混勻，37 度水浴10min。此步為消化線粒體表面吸附的核DNA。4℃，12,000 ×g 離心5 min。盡可能的棄上清，再加入200μL TE緩沖液重懸線粒體沉淀，12,000 ×g 離心5 min，洗去殘留的DNA 酶；

8. 得到的沉淀，用200μL TE緩沖液重懸線粒體沉淀。加入10μL RNase A。加入200μL 線粒體裂解液，輕輕混勻（不可吹打），放置1-2min 左右，不超過5min，再加入150μL 蛋白沉淀液，迅速混勻。4℃，12,000 ×g 離心5 min。此步驟可進一步去除核DNA；

9. 取上清，加入一新的離心管中（如用于酶切分析，可加入此步：可選用等體積的酚氯仿異戊醇25:24:1 抽提一次，再用氯仿抽提一次，或者直接用氯仿抽提兩次，一般來說，此步可去掉一些微量蛋白及糖類，但會造成線粒體DNA 的損失，因而用于PCR 時可省，并不影響后續(xù)實驗），加入6 倍體積的異丙醇（如無異丙醇，可加入2.5 倍體積的乙醇沉淀DNA，如離心管太滿可分兩管）及5-10μL核酸助沉劑，混勻，-20℃沉淀半小時左右（此步可?。?，4℃，12,000 ×g 離心10 min；

10. 棄上清，再加入1ml 70%乙醇清洗，4℃，12,000 ×g 離心10 min。重復用70%乙醇洗一次；

11. 棄上清，再次離心1min 吸棄上清，不要碰到管底，開蓋涼干約5-10 min；

12. 加入20-30μL TE 緩沖液，輕彈管底，37 ℃水浴5 分鐘，線粒體DNA 溶解；

13. 進行DNA 電泳檢測及-20 ℃保存，進行下步的實驗。

方法三：堿裂解法（快速、適用于PCR）

適用于對純度要求不高、只需快速檢測mtDNA（如基因分型、缺失檢測）的情況。

簡要流程

1. 細胞或組織用堿性裂解液（如NaOH-SDS）直接裂解。

2. 用高鹽溶液沉淀蛋白質和染色體DNA。

3. 上清中含有小分子的mtDNA（因其呈共價閉合環(huán)狀，在堿性條件下變性后能迅速復性），可用異丙醇或乙醇沉淀出來。

4. 沉淀用70%乙醇洗滌后溶解。

關鍵注意事項與優(yōu)化建議

1. 材料新鮮度：起始材料必須新鮮，或迅速冷凍于-80°C。線粒體在凋亡或壞死細胞中極易受損，導致mtDNA釋放并降解。

2. 全程低溫操作：除裂解和孵育步驟外，所有操作均在冰上進行，使用預冷的緩沖液和離心機，以抑制核酸酶活性。

3. 避免機械損傷：勻漿或渦旋力度要溫和，過度剪切力會破壞線粒體。

4. 去除核DNA污染：

• DNase I 處理：是去除核污染zui有效的手段。

• 長片段PCR驗證：用特異性引物擴增一個長片段（如>8 kb）的mtDNA區(qū)域。如果核污染嚴重，長片段擴增會失?。ê薉NA在提取過程中易被剪切）。

5. 去除RNA污染：必須用 無DNase的RNase A 進行徹di消化。

6. 濃度與完整性檢測：

• 瓊脂糖凝膠電泳：純凈的mtDNA應在約16.5 kb處顯示一條清晰條帶（動物細胞）。出現拖尾或小片段表明降解；出現更高分子量條帶可能為核DNA污染。

• 紫外分光光度計：檢測A260/A280（~1.8）和A260/A230（>2.0）比值，評估蛋白質及鹽等雜質污染。

• qPCR：使用核DNA和mtDNA的特異性引物進行定量，可以精確計算核DNA污染比例。

總結與選擇建議

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