主要用途

細(xì)胞蛋白磷酸酶1（PP1）活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在使用使用特異性底物糖原磷酸化酶a，在PP2A抑制劑存在下，受到PP1去磷酸化后，釋放出游離磷酸根，由硫酸亞鐵氨還原產(chǎn)生鉬藍(lán)顯色反應(yīng)后峰值的變化，即采用比色法測(cè)定單位酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適合于各種細(xì)胞裂解懸液樣品包括免疫沉淀復(fù)合物和粗提或部分純化酶樣品的蛋白磷酸化酶1活性及其抑制劑的檢測(cè)。廣泛應(yīng)用于細(xì)胞凋亡、蛋白組學(xué)、病理生理學(xué)變等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測(cè)敏感。

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）        毫升

裂解液（Reagent B）          毫升

緩沖液（Reagent C）        毫升

陰性液（Reagent D）          毫升

反應(yīng)液（Reagent E）         微升

顯色液（Reagent F）         毫升

標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）         微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)              1份

保存方式

保存裂解液（Reagent B）、緩沖液（Reagent C）、反應(yīng)液（Reagent E）和顯色液（Reagent F）在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；其余的保存在4℃冰箱里；顯色液（Reagent F）具有腐蝕性，避免直接用手接觸；有效保證6月

用戶(hù)自備

15毫升離心管：用于樣品處理的容器

1.5毫升離心管：用于樣品處理和保存的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于貼壁細(xì)胞脫離

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品收集

培養(yǎng)箱：用于孵育反應(yīng)物

平式搖蕩儀：用于混勻反應(yīng)物

500微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液放進(jìn)冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

一、 樣品準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（5 X 10⁷細(xì)胞）

2． 小心加入xx毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞 

5． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞

6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開(kāi)始）

7． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

11． 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

15． 移取2微升進(jìn)行蛋白定量測(cè)定（注意：建議使用 Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

16． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、測(cè)定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)胞裂解萃取液等），置于冰槽里（注意：樣品須澄清）

2． 設(shè)定好分光光度儀或酶標(biāo)儀（溫度為37℃）：波長(zhǎng)為660nm，并置零  

3． 準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號(hào)管

4． 按下表分別加入陰性液（Reagent D）和標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）到每個(gè)離心管，混勻

5． 將1至5號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見(jiàn)下表

三、 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定

1． 移取200微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液到新的比色皿

2． 在30℃溫度下孵育10分鐘

3． 加入xx微升顯色液（Reagent F），混勻

4． 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照

5． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)

6． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1至5四次

1． 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光單位（A）；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)磷濃度（微摩爾/升）

三、 樣品背景測(cè)定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入20微升待測(cè)樣品（總量100微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白；作為樣品背景） 

3． 在30℃溫度下孵育10分鐘

4． 加入xx微升陰性液（Reagent D），混勻

5． 加入xx微升顯色液（Reagent F），混勻

6． 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照

7． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)

8． 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)獲得樣品背景對(duì)應(yīng)磷濃度（微摩爾/升）

四、 樣品活性測(cè)定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入20微升待測(cè)樣品（總量100微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白） 

3． 在30℃溫度下孵育2分鐘

4． 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）

5． 在30℃溫度下孵育10分鐘

6． 加入xx微升陰性液（Reagent D），混勻

7． 加入xx微升顯色液（Reagent F），混勻

8． 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照

9． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)

10． 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)獲得樣品活性對(duì)應(yīng)磷濃度（微摩爾/升）

五、 計(jì)算樣品活性

七、酶標(biāo)儀測(cè)定

1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：標(biāo)準(zhǔn)樣品、樣品背景、樣品活性

2． 分別移取100微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)樣品孔里

3． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到樣品背景和待測(cè)樣品孔里

4． 分別加入10微升待測(cè)樣品（總量100微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白）到樣品背景和樣品活性孔里

5． 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）到樣品活性孔里

6． 加入xx微升陰性液（Reagent D）到樣品背景孔里

7． 在30℃溫度下，置于平式搖蕩儀孵育10分鐘，速度為50RPM

8． 分別加入xx微升陰性液（Reagent D）到樣品背景和待測(cè)樣品孔里

9． 分別加入xx微升顯色液（Reagent F）到所有孔里

10． 在37℃溫度下，置于平式搖蕩儀孵育10分鐘，速度為50RPM，避免光照

11． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)

12． 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光單位（A）；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)磷濃度（微摩爾/升）

13． 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)獲得樣品對(duì)應(yīng)磷濃度（微摩爾/升）

14． 計(jì)算樣品活性

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為25次操作，包括5次（點(diǎn)）標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過(guò)程中，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定只需1條

4． 顯色液（Reagent F）具有腐蝕性，避免直接用手接觸

5． 樣品切忌使用磷酸緩沖液、EDTA、EGTA和脫氧膽酸納處理

6． 比色測(cè)定后，比色皿須清洗

7． 如果用戶(hù)沒(méi)有660nm波長(zhǎng)，可以使用600至660nm的任一波長(zhǎng)替代

8． 吸光讀數(shù)增高，表明具有酶活性

9． 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為100微克/20微升；如果樣本酶活性過(guò)低或過(guò)高，則可以增加或降低樣本量； （本公司提供 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

10． 蛋白磷酸酶1活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 7.4的情況下，每單位酶在單位時(shí)間內(nèi)（每分鐘）釋放1微摩爾的磷

11． 本公司提供系列磷酸化酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品