導(dǎo)語：鄰近標記（Proximity Labeling, PL）是繪制細胞“空間蛋白質(zhì)組學(xué)"的神兵利器，但面對原代T細胞這類“硬骨頭"（難轉(zhuǎn)染、體外存活短），傳統(tǒng)工具往往力不從心。近期，中山大學(xué)腫瘤防治中心的研究團隊在BBRC上發(fā)表了一項創(chuàng)新工作：他們基于酪氨酸酶BmTyr搭建了一套生物正交鄰近標記平臺在該研究中，團隊借助 Nanoportal Biotech 自主研發(fā)的 ProteanFect® 功效型轉(zhuǎn)染試劑，成功攻克了原代 T 細胞極難轉(zhuǎn)染的傳統(tǒng)痛點，高效遞送 mRNA 并實現(xiàn)了亞細胞水平的精準標記。 結(jié)合全新的 HiBiT/His 雙標簽系統(tǒng)，該團隊成功繪制了原代 T 細胞的核蛋白組動態(tài)圖譜，并意外發(fā)現(xiàn)了蛋白 NKAP 的“染色質(zhì)定位"新功能。

研究背景：鄰近標記的“阿喀琉斯之踵"

想要知道細胞內(nèi)誰和誰互作、特定細胞器里有哪些蛋白，傳統(tǒng)方法是裂解細胞后做Co-IP，但這會破壞瞬時互作，還可能產(chǎn)生人為假陽性。鄰近標記技術(shù)（如BioID、APEX2）通過表達融合酶，在活細胞內(nèi)給“鄰居蛋白"貼標簽，再結(jié)合質(zhì)譜分析，規(guī)避了這些問題。

但現(xiàn)有工具各有短板：

·  BioID/TurboID（生物素連接酶）：依賴內(nèi)源生物素途徑，背景高；

·  APEX2（過氧化物酶）：需要添加具有細胞毒性的 H?O?，對嬌貴的原代細胞（如懸浮生長的T細胞）很不友好；

通用痛點：原代T細胞極難轉(zhuǎn)染，且體外培養(yǎng)壽命短，常規(guī)質(zhì)粒或病毒轉(zhuǎn)染引發(fā)的先天免疫響應(yīng)還會干擾免疫信號研究。

為此，該研究團隊將目光投向了 BmTyr（細菌酪氨酸酶）。這是一種銅依賴酶，能將苯酚探針氧化為鄰醌，進而標記鄰近蛋白。它不需要H?O?，條件溫和，非常適合敏感的原代細胞。

核心創(chuàng)新：一套“好用、靈敏、易洗脫"的全新工具箱

1. 優(yōu)化探針與反應(yīng)體系 

團隊比較了傳統(tǒng)的生物素-苯酚（Biotin-phenol）和分子量更小的炔基-苯酚（Alkyne-phenol）(圖1A)。對炔基苯酚濃度進行了滴定。濃度低于0.015 mM未檢測到信號，而0.5 mM導(dǎo)致彌散的非核標記，表明是非特異性探針結(jié)合。中間濃度0.15 mM炔基苯酚提供了最佳的信號背景比和精確的核限制性（圖1D和E）。他們還將酶定位在細胞核（mCherry-BmTyr-H2B），驗證了其在亞細胞水平上的精準標記能力。

圖1 生物素-苯酚與炔基-苯酚探針在BmTyr介導(dǎo)的鄰近標記中的比較

2. 攻克“洗脫難"：HiBiT/His 雙標簽系統(tǒng) 

這是本文的一大技術(shù)亮點。傳統(tǒng)的富集金標準是用疊氮-生物素（Azide-biotin）結(jié)合鏈霉親和素（Streptavidin），但生物素-親和素結(jié)合太牢，洗脫極其困難，導(dǎo)致后續(xù)Western Blot驗證效率低下。

解決方案：合成一種定制的疊氮-HiBiT標簽，用于與炔基標記的蛋白質(zhì)組偶聯(lián)（圖2A）。

His標簽：負責通過Ni-NTA磁珠高效捕獲和溫和洗脫蛋白；

HiBiT標簽：這是一個僅11個氨基酸的微小肽段，能與LgBiT蛋白互補形成納米螢光素酶，實現(xiàn)超靈敏的化學(xué)發(fā)光檢測（無需抗體?。?。

為降低成本，團隊將定制的疊氮-HiBiT標簽與市售的疊氮-6×His或疊氮-10×His標簽按等摩爾比混合（圖2B和C）。兩種His標簽變體都成功富集了炔基標記的蛋白質(zhì)組，其中疊氮-10×His提供了略優(yōu)的富集效率（圖2D和E）。隨后的HiBiT標簽實現(xiàn)了對洗脫蛋白的靈敏化學(xué)發(fā)光檢測，滿足了高靈敏度， 生物正交性， 高效洗脫性的初始設(shè)計標準。

圖2利用雙疊氮標簽系統(tǒng)對鄰近標記蛋白質(zhì)組進行免疫沉淀及化學(xué)發(fā)光檢測

3. BmTyr用于原代T細胞核蛋白質(zhì)組的質(zhì)譜分析 

平臺應(yīng)用于原代T細胞解決方案：

·  遞送：采用ProteanFect介導(dǎo)的mRNA轉(zhuǎn)染，12小時內(nèi)即可表達蛋白，避免了DNA引起的cGAS-STING通路激活（這點在免疫細胞中至關(guān)重要），轉(zhuǎn)染效率超50%（圖3C）。

·  安全性：優(yōu)化了Cu2?濃度（僅10 μM，遠低于常規(guī)CuAAC的4 mM），流式細胞術(shù)證實對T細胞無明顯毒性（圖3A）。

隨后，將這一優(yōu)化系統(tǒng)應(yīng)用于分析腫瘤壞死因子-α（TNFα）刺激后T細胞核蛋白質(zhì)組的變化。構(gòu)建野生型（WT）和TNFR1敲除（TNFR1-KO）T細胞，使其表達核定位的mCherry-BmTyr-H2B融合蛋白，用TNFα（10 ng/ml，6小時）處理并進行鄰近標記。質(zhì)譜分析鑒定出116個變化顯著的核蛋白，其中20個蛋白在WT+TNFα組中特異性富集，且在TNFR1-KO組中無變化（圖3F），主要涉及轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳調(diào)控，完·美驗證了平臺的可靠性（圖3G）。

圖3原代T細胞核蛋白質(zhì)組的鄰近標記與質(zhì)譜分析

生物學(xué)發(fā)現(xiàn)：繪制圖譜與NKAP的新故事

NKAP是NF-κB激活蛋白，已知TNFα刺激后核轉(zhuǎn)位，但其染色質(zhì)結(jié)合機制未知，故被選為驗證靶點。

·  利用新的HiBiT/His標簽系統(tǒng)捕獲發(fā)現(xiàn)：TNFα刺激后，與染色質(zhì)關(guān)聯(lián)的NKAP顯著增多，而總核蛋白水平變化不大（圖4B）。

·  在骨髓來源巨噬細胞（BMDM）中重復(fù)實驗，得到完·全一致結(jié)果：NKAP以TNFR1依賴的方式結(jié)合染色質(zhì)這一現(xiàn)象，在不同原代細胞中可重復(fù)，進而佐證了本研究體系具有普適性，而非T細胞特·有（圖4E）。

這意味著，TNFα-TNFR1信號并未簡單改變NKAP的總量或核質(zhì)分布，而是促進了NKAP與染色質(zhì)的穩(wěn)定結(jié)合（可能涉及HDAC復(fù)合物），為其轉(zhuǎn)錄抑制功能提供了新視角。

圖4 NKAP作為TNFα信號通路染色質(zhì)相關(guān)下游效應(yīng)分子的驗證

總結(jié)與展望

這項研究開發(fā)的 BmTyr 無生物素鄰近標記平臺，以溫和低毒、高效精準、兼容點擊化學(xué)的核心優(yōu)勢，徹·底解決了原代 T 細胞等難轉(zhuǎn)染細胞的亞細胞蛋白質(zhì)組解析難題。

    值得一提的是，Nanoportal Biotech 的 ProteanFect® 轉(zhuǎn)染試劑在本次攻堅克難中展現(xiàn)了卓·越的性能——它不僅攻克了原代免疫細胞“難轉(zhuǎn)染"的阿喀琉斯之踵，更以高效率、低毒性、不激活先天免疫的高標準，完·美保障了后續(xù)質(zhì)譜鑒定與功能驗證的順利進行。  

    ProteanFect® 始終致力于為“難轉(zhuǎn)染"細胞與前沿遞送研究提供最·強技術(shù)底座。無論您的研究是深耕空間蛋白質(zhì)組學(xué)，還是聚焦前沿基因與細胞治療，ProteanFect® 都能助力您的科研工作加速沖刺！

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