抗體藥物偶聯(lián)物(ADCs)是一類前沿生物制藥產(chǎn)品，將高選擇性的單克隆抗體與強(qiáng)效細(xì)胞毒性小分子結(jié)合，已成為腫瘤靶向治療的重要方向。目前全球已有14款A(yù)DC獲批上市，數(shù)百個(gè)項(xiàng)目處于臨床與研發(fā)階段。^[2]

由于ADC兼具生物大分子與小分子藥物雙重屬性，F(xiàn)DA、EMA等監(jiān)管機(jī)構(gòu)均要求對(duì)其進(jìn)行雙重表征，既要明確DAR、偶聯(lián)位點(diǎn)，也要評(píng)估高級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與抗原結(jié)合功能。

質(zhì)譜(MS)長(zhǎng)期以來(lái)是測(cè)定DAR的標(biāo)準(zhǔn)手段，但無(wú)法提供：

借助TA儀器的Nano DSC納瓦級(jí)差示掃描量熱儀和Affinity ITC等溫滴定量熱儀，研究人員可以在溶液狀態(tài)下、無(wú)標(biāo)記、原位表征ADC穩(wěn)定性與結(jié)合行為，彌補(bǔ)質(zhì)譜短板。

偶聯(lián)引發(fā)的穩(wěn)定性風(fēng)險(xiǎn)

在ADC制備中，疏水性小分子藥物偶聯(lián)到親水性抗體上，會(huì)破壞水分子網(wǎng)絡(luò)與分子間次級(jí)相互作用，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。不穩(wěn)定的ADC易出現(xiàn)各種問(wèn)題：^[3]

- 小分子藥物提前釋放

- 抗體聚集、沉淀

- 脫靶毒性增加

- 療效與安全性大幅下降

Nano DSC

親本抗體與ADC穩(wěn)定性對(duì)比實(shí)驗(yàn)

TA儀器的Nano DSC是一款用于稀溶液中生物分子穩(wěn)定性測(cè)量的微量熱儀，可輕松完成穩(wěn)定性表征。圖1展示了曲妥珠單抗(親本抗體)與T-DM1(賴氨酸偶聯(lián)ADC)的Nano DSC升溫掃描曲線。親本單克隆抗體在70℃以下保持穩(wěn)定，而該ADC的聚集和解折疊起始溫度低至45℃。這種向左的熱偏移表明穩(wěn)定性降低；該數(shù)據(jù)可幫助研發(fā)人員在制劑開(kāi)發(fā)早期預(yù)測(cè)產(chǎn)品保質(zhì)期和聚集風(fēng)險(xiǎn)。

圖1：曲妥珠單抗(親本抗體)

與T-DM1(賴氨酸偶聯(lián)物)的Nano DSC分析

RS-DSC

高通量制劑緩沖液篩選實(shí)驗(yàn)

制劑篩選還需要在多種市售緩沖液中測(cè)試ADC的性能。Nano DSC能夠檢測(cè)不同緩沖液環(huán)境下解折疊曲線的細(xì)微變化，幫助科研人員篩選制劑配方，以抵消偶聯(lián)反應(yīng)帶來(lái)的不穩(wěn)定性。為滿足更高通量需求，TA儀器的快速篩選差示掃描量熱儀(RS-DSC)可同時(shí)檢測(cè)多達(dá)24個(gè)樣品，且支持濃度高于20mg/mL的制劑級(jí)樣品。以下案例中，研究人員使用RS-DSC測(cè)試了赫賽汀(曲妥珠單抗)在組氨酸、硼酸鹽、磷酸鹽緩沖液(PBS)和琥珀酸鹽緩沖液中的熱穩(wěn)定性。^[5]

圖2與表1：使用RS-DSC對(duì)50mg/mL濃度的抗體

進(jìn)行三次重復(fù)掃描，通過(guò)自動(dòng)T_max

和基線檢測(cè)生成的疊加熱譜圖

組氨酸、硼酸鹽和PBS緩沖液對(duì)第一個(gè)解折疊過(guò)程無(wú)顯著影響，但琥珀酸鹽緩沖液會(huì)使CH2結(jié)構(gòu)域不穩(wěn)定，導(dǎo)致解折疊起始溫度和T_max,?降低約3℃。在主要的熱轉(zhuǎn)變過(guò)程中，組氨酸和琥珀酸鹽緩沖液的穩(wěn)定效果佳。不出所料，在本組樣品中，曲妥珠單抗穩(wěn)定的緩沖液配方正是已獲批藥品最終制劑所使用的組氨酸緩沖液。

偶聯(lián)對(duì)結(jié)合親和力的潛在影響

ADC的研發(fā)需要對(duì)抗體進(jìn)行修飾，以實(shí)現(xiàn)藥物偶聯(lián)，提高腫瘤靶向性和體內(nèi)清除率。然而對(duì)抗體的修飾(疏水性改變、CDR區(qū)附近賴氨酸非特異性偶聯(lián))可能削弱抗原結(jié)合能力，直接影響藥效。

傳統(tǒng)的表面等離子體共振(SPR)和生物層干涉法(BLI)可測(cè)結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)，但只有等溫滴定量熱法(ITC)這種直接的溶液內(nèi)檢測(cè)方法能提供完整的結(jié)合熱力學(xué)信息：

ITC是精細(xì)結(jié)合表征的金標(biāo)準(zhǔn)，且ITC在溶液中無(wú)固定、無(wú)標(biāo)記，可避免SPR和BLI中常見(jiàn)的假信號(hào)。

例如以下ITC實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別展示了曲妥珠單抗親本抗體和其ADC與HER2抗原結(jié)合的滴定結(jié)果。該曲妥珠單抗ADC的解離常數(shù)(~3 nM)與親本抗體相當(dāng)，焓變(-96 kJ/mol)也與親本抗體相似。ITC對(duì)于確認(rèn)抗體的任何修飾未對(duì)其結(jié)合親和力和特異性產(chǎn)生不利影響至關(guān)重要。

圖3：ITC結(jié)合等溫線：A)親本抗體(曲妥珠單抗)；

B)ADC在天然無(wú)固定條件下與HER2的結(jié)合

隨著ADC技術(shù)的不斷發(fā)展，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜性也日益增加。

技術(shù)演進(jìn)帶來(lái)了新的分析挑戰(zhàn)，也暴露了現(xiàn)有分析手段的局限。盡管液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)仍是定位偶聯(lián)位點(diǎn)和計(jì)算平均DAR的核心工具，但它無(wú)法全面反映結(jié)構(gòu)修飾帶來(lái)的熱力學(xué)變化。

隨著偶聯(lián)位點(diǎn)數(shù)量、藥物類型和連接子化學(xué)的不斷拓展，Nano DSC應(yīng)對(duì)復(fù)雜ADC的價(jià)值日益顯現(xiàn)。Nano DSC可直接測(cè)定解折疊轉(zhuǎn)變溫度、聚集起始溫度以及不同偶聯(lián)位點(diǎn)/連接子/載荷對(duì)穩(wěn)定性的影響，從而在早期判斷新型ADC在實(shí)際應(yīng)用條件下是否能保持穩(wěn)定，是否會(huì)發(fā)生聚集或析出，降低后期開(kāi)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。

ADC的成功開(kāi)發(fā)必須建立全面、多維度的表征體系，不能僅依賴質(zhì)譜。沃特世可提供完整的解決方案，賦能新一代ADC及各類抗體藥物的研發(fā)加速。

? 高通量篩選制劑緩沖液

? 預(yù)測(cè)聚集風(fēng)險(xiǎn)與貨架期

? 滿足FDA/EMA高級(jí)結(jié)構(gòu)評(píng)價(jià)要求

? 確認(rèn)偶聯(lián)不損害抗原親和力

? 提供SPR/BLI無(wú)法實(shí)現(xiàn)的完整熱力學(xué)數(shù)據(jù)

本文改編自Shawn C. Owen博士為沃特世-TA儀器與生物工藝在線(Bioprocess Online)合作舉辦的網(wǎng)絡(luò)研討會(huì)內(nèi)容，由沃特世材料科學(xué)事業(yè)部的Morgan Ulrich、Calliste Scholl和丁純潔撰寫(xiě)，范洋晶校對(duì)。