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【學(xué)術(shù)前沿】三種樣品處理方法下MALDI-TOF鑒定絲狀真菌效果比較
閱讀：138 發(fā)布時(shí)間：2026-4-29背景：
絲狀真菌引起的侵襲性感染是免疫功能低下患者發(fā)病和死亡的主要原因?？焖?、準(zhǔn)確地鑒定絲狀真菌對(duì)于及時(shí)啟動(dòng)合適的抗真菌治療至關(guān)重要。傳統(tǒng)的鑒定方法（基于形態(tài)學(xué)）耗時(shí)且依賴專家經(jīng)驗(yàn)，而分子技術(shù)（如測(cè)序）成本高、速度慢，限制了其在常規(guī)診斷中的應(yīng)用。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）已成為細(xì)菌和酵母菌快速鑒定的有效工具，并逐漸應(yīng)用于絲狀真菌的鑒定。然而，其鑒定成功率受數(shù)據(jù)庫(kù)覆蓋度和樣本制備方法的影響。
目的
? 評(píng)估并比較制造商推薦的三種不同樣本制備方法（改良直涂法、提取法、液體培養(yǎng)法）對(duì)230株絲狀真菌分離株在屬和種水平上的鑒定率影響。
? 驗(yàn)證一個(gè)內(nèi)部設(shè)定的、更低的種水平鑒定閾值（logscore ≥1.70）是否能在不增加錯(cuò)誤鑒定的前提下，提高種水平的正確鑒定率。
實(shí)驗(yàn)方法
? 研究對(duì)象：230株絲狀真菌分離株（185株臨床分離株 + 45株參考菌株），均通過傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法（部分輔以ITS2區(qū)域測(cè)序）進(jìn)行鑒定。
? MALDI-TOF MS平臺(tái)：使用商業(yè)微生物質(zhì)譜系統(tǒng)及其商業(yè)化的絲狀真菌數(shù)據(jù)庫(kù)。
? 樣本制備：對(duì)每株分離株分別采用三種方法：
改良直涂法 (Extended direct transfer)：簡(jiǎn)單快速的方法。5分鐘
提取法 (Extraction)：通過乙醇/甲酸處理提取蛋白質(zhì)，步驟更復(fù)雜。15分鐘
液體培養(yǎng)法 ：先在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再進(jìn)行提取，最為耗時(shí)。24小時(shí)
結(jié)果判讀：
? 制造商標(biāo)準(zhǔn)：logscore ≥2.0為高可信度（種水平），1.70-1.99為低可信度（屬水平），<1.70為無法鑒定。
? 內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)：將種水平鑒定的閾值降低至 logscore ≥1.70。
? 驗(yàn)證：將MALDI-TOF MS的鑒定結(jié)果與傳統(tǒng)方法（金標(biāo)準(zhǔn)）的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，評(píng)估正確率和錯(cuò)誤率。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
? 樣本制備方法的影響：
更復(fù)雜的樣本制備方法顯著提高了種水平的鑒定率。改良直涂法：種水平鑒定率為48.9%。提取法：種水平鑒定率提升至 62.0%。液體培養(yǎng)法：種水平鑒定率達(dá)到最高的 76.1%。在所有情況下，均未發(fā)生錯(cuò)誤鑒定（即沒有將A菌鑒定為B菌）。
圖1.使用三種不同樣本提取方法對(duì)菌種進(jìn)行 MALDI-TOF MS 結(jié)果分析（部分）
? 內(nèi)部閾值（≥1.70）的效果：
應(yīng)用更低的閾值后，種水平的正確鑒定率進(jìn)一步大幅提升。使用液體培養(yǎng)法結(jié)合內(nèi)部閾值，種水平鑒定率最高可達(dá) 86.4%。
圖2.三類提取方法鑒定成功率比對(duì)
大微實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證：
依據(jù)文獻(xiàn)中的技術(shù)路線，本實(shí)驗(yàn)室采用DW-MS 5500系統(tǒng)對(duì)黑曲霉Aspergillus niger進(jìn)行改良直涂法和提取法分別進(jìn)行處理，從譜圖和系統(tǒng)評(píng)分可直觀判斷兩種方法的鑒定表現(xiàn)；改良直涂法并不能很好的將黑曲霉胞內(nèi)的蛋白提取出，從而導(dǎo)致特征峰無法被儀器收集，評(píng)分低于<1.70判定為鑒定失敗；而提取法使得胞內(nèi)容物更多被析出，鑒定結(jié)果置信度高且特征峰明顯。
圖3.改良直涂法鑒定譜圖（大微實(shí)驗(yàn)室測(cè)試結(jié)果）
圖4.提取法鑒定譜圖（大微實(shí)驗(yàn)室測(cè)試結(jié)果）
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
? MALDI-TOF MS平臺(tái)適用性：結(jié)合商業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)和標(biāo)準(zhǔn)化的樣本制備流程，MALDI-TOF MS能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)絲狀真菌的高準(zhǔn)確率鑒定，適用于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。
? 樣本制備策略：遵循制造商推薦的分步策略（先用改良直涂法，如鑒定失敗后再用提取法）進(jìn)行樣本制備是有效的，因?yàn)?/span>操作上更復(fù)雜的制備方法（提取法）能顯著提高絲狀真菌的鑒定成功率。
? 內(nèi)部閾值驗(yàn)證：將絲狀真菌的種水平鑒定閾值從≥2.0降低至≥1.70是安全且有效的。該策略能顯著提高種水平的鑒定率，同時(shí)幾乎不引入錯(cuò)誤鑒定（僅一例可解釋的輕微錯(cuò)誤）。因此，該內(nèi)部閾值可以在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中被采納和應(yīng)用。