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北京西美杰科技有限公司
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INDUCE-seq：一種用于評(píng)估基因編輯療法安全性的高精度DNA斷裂檢測技術(shù)
2026-5-15 閱讀(48)
背景與需求
基因組編輯技術(shù)的突破性進(jìn)展顯著促進(jìn)了新型細(xì)胞與基因療法的開發(fā)。該技術(shù)不僅能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)有基因的精準(zhǔn)修飾，還可用于構(gòu)建合成基因，在異基因治療中構(gòu)建免疫相容性細(xì)胞，為臨床提供“現(xiàn)成"治療方案。然而，基因編輯技術(shù)的安全有效應(yīng)用仍有賴于新型工具的開發(fā)。其潛在風(fēng)險(xiǎn)主要來自兩方面：一是在培養(yǎng)過程中獲得的突變可能導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，以及在具有DNA修復(fù)缺陷的細(xì)胞中引發(fā)基因組不穩(wěn)定性；二是編輯工具可能在基因組非目標(biāo)位點(diǎn)引發(fā)DNA斷裂，產(chǎn)生脫靶效應(yīng)。脫靶編輯可能激活原癌基因或破壞抑癌基因，從而推動(dòng)腫瘤發(fā)生。此外，脫靶誘變還可能產(chǎn)生新抗原，誘發(fā)自身免疫反應(yīng)或其他細(xì)胞功能障礙。
因此，開發(fā)一種能在全基因組范圍內(nèi)高精度、無偏倚地檢測編輯誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂（DSB）的技術(shù)，對(duì)于評(píng)估基因編輯療法的安全性、加速其臨床轉(zhuǎn)化具有核心意義。
技術(shù)方案：INDUCE-seq 的原理
INDUCE-seq是一種可擴(kuò)展的DNA斷裂定位與表征平臺(tái)技術(shù)。它旨在解決上述安全性評(píng)估難題，其核心在于利用一種新型的無PCR原位斷裂捕獲方法。
? 無PCR偏差：INDUCE-seq 是無偏倚的、基于細(xì)胞的解決方案，根本上避免了因PCR擴(kuò)增偏好性，確保了檢測結(jié)果的客觀性與真實(shí)性。
? 廣泛兼容性：INDUCE-seq具有廣泛的細(xì)胞類型兼容性，與多種治療相關(guān)的細(xì)胞類型兼容，并適用于任何基于核酸酶的基因編輯系統(tǒng)，普適性強(qiáng)。
? 高精度檢測：INDUCE-seq能夠以高精度檢測任何基于核酸酶的基因組編輯系統(tǒng)誘導(dǎo)的DNA斷裂。
INDUCE-seq工作原理
如圖1所示：在CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因編輯過程中，其核心步驟可分為兩個(gè)連續(xù)的生物學(xué)階段，并分別對(duì)應(yīng)特定的高通量測序檢測方法以實(shí)現(xiàn)對(duì)編輯事件的精準(zhǔn)解析。第一階段為基因編輯的“啟動(dòng)期"（Initiating Phase），即Cas9核酸酶在sgRNA引導(dǎo)下于預(yù)設(shè)基因組靶位點(diǎn)（通常鄰近PAM序列）誘導(dǎo)產(chǎn)生雙鏈斷裂（Double-Strand Break, DSB），該過程伴隨基因組不穩(wěn)定性與DNA斷裂事件的發(fā)生；
INDUCE-seq技術(shù)的核心創(chuàng)新即在于此階段——它通過在細(xì)胞原位對(duì)DSB末端進(jìn)行特異性標(biāo)記（如連接化學(xué)修飾的P5測序接頭），實(shí)現(xiàn)對(duì)斷裂位點(diǎn)的高精度捕獲與定位，且因建庫過程無PCR擴(kuò)增，每個(gè)測序讀長嚴(yán)格對(duì)應(yīng)單個(gè)DSB事件，從而獲得無偏倚的1:1斷裂信號(hào)表征。第二階段為“編輯期"（Editing Phase），細(xì)胞啟動(dòng)內(nèi)源性DNA修復(fù)機(jī)制，包括易出錯(cuò)的非同源末端連接（NHEJ）或精確的同源定向修復(fù)（HDR，需供體DNA模板），修復(fù)結(jié)果在靶位點(diǎn)引入插入、缺失、框移或點(diǎn)突變等遺傳改變，最終實(shí)現(xiàn)基因敲入、敲除、條件性等位基因構(gòu)建或報(bào)告基因整合等基因修飾目標(biāo)；此階段的遺傳變化可通過Duplex-seq等高通量方法進(jìn)行檢測。因此，INDUCE-seq與Duplex-seq分別從“斷裂發(fā)生"與“修復(fù)結(jié)果"兩個(gè)維度，構(gòu)建了從DNA損傷到基因編輯終產(chǎn)物的完整監(jiān)測體系，為解析CRISPR編輯的動(dòng)態(tài)機(jī)制與優(yōu)化編輯效率提供了系統(tǒng)性的實(shí)驗(yàn)框架。
INDUCE-seq操作流程
如圖2所示，在原位斷裂標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，首先對(duì)固定并透化的細(xì)胞進(jìn)行DSB末端標(biāo)記：通過將經(jīng)化學(xué)修飾的全長P5測序接頭連接至經(jīng)末端預(yù)處理（如末端修復(fù)與平端化）的DSB末端，實(shí)現(xiàn)斷裂位點(diǎn)的特異性標(biāo)簽化。隨后，提取基因組DNA（gDNA），經(jīng)物理或酶促片段化處理，并對(duì)片段末端再次進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)處理，以確保接頭連接的兼容性。接著，使用經(jīng)化學(xué)修飾的半功能性P7測序接頭進(jìn)行二次連接，從而在DNA文庫中形成兩類片段：一類為功能性DSB標(biāo)記片段（P5:P7結(jié)構(gòu)，攜帶DSB標(biāo)簽），另一類為非功能性基因組背景片段（P7:P7結(jié)構(gòu)，無DSB標(biāo)簽）。在測序前，通過流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cell Enrichment）對(duì)文庫進(jìn)行富集，選擇性捕獲并保留P5:P7結(jié)構(gòu)片段，從而高效去除非功能性P7:P7背景DNA。由于INDUCE-seq建庫流程避免了PCR擴(kuò)增步驟，每個(gè)測序讀長（read）在統(tǒng)計(jì)學(xué)上嚴(yán)格對(duì)應(yīng)單個(gè)細(xì)胞中一個(gè)被標(biāo)記的DSB末端，確保斷裂事件的定量表征無擴(kuò)增偏差。與依賴PCR的非NGS方法相比，該方法實(shí)現(xiàn)了DSB信號(hào)的1:1無偏映射，避免了PCR引入的擴(kuò)增偏好性與信號(hào)失真，從而提供更精確、可重復(fù)的基因組斷裂圖譜。
獨(dú)立驗(yàn)證：HESI 交叉驗(yàn)證研究
一項(xiàng)在健康與環(huán)境科學(xué)研究所（HESI）的CT-TRACS委員會(huì)框架下開展的試點(diǎn)研究，旨在評(píng)估INDUCE-seq方法的可靠性。其設(shè)計(jì)是使用兩種不同的細(xì)胞類型（GM24385和MCF10A），對(duì)五個(gè)經(jīng)過充分研究的遺傳靶點(diǎn)進(jìn)行CRISPR-Cas9基因編輯，該技術(shù)可實(shí)現(xiàn)突變位點(diǎn)的高靈敏度檢測。
流程一 測量基因組中的斷裂，評(píng)估靶向和非靶向基因編輯
基于INDUCE-seq技術(shù)獨(dú)特的數(shù)字讀數(shù)特性，開發(fā)的脫靶位點(diǎn)篩選流程整合了斷裂重復(fù)序列分析與引導(dǎo)RNA同源性分析，可生成潛在脫靶位點(diǎn)的超集，其分層報(bào)告系統(tǒng)支持將位點(diǎn)分為常見型、無偏型和序列依賴型三類并進(jìn)行概率分析，HBD基因編輯位點(diǎn)的斷裂分布可視化結(jié)果如圖所示
流程二 高保真糾錯(cuò)測序技術(shù)定量位點(diǎn)的遺傳變化
如圖所示高置信度類別脫靶突變，表明斷裂計(jì)數(shù)與突變積累之間存在顯著比例關(guān)系。其中對(duì)照樣本中的突變率反映了突變的背景水平。
INDUCE-seq性能驗(yàn)證
如表1所示，NDUCE-seq表現(xiàn)出優(yōu)異的檢測性能。
性能指標(biāo) | ||
敏感度 | 在內(nèi)源性斷裂背景下識(shí)別編輯誘導(dǎo)斷裂的能力 | ~94% |
特異性 | 區(qū)分低復(fù)發(fā)率的內(nèi)源性與誘導(dǎo)性斷裂的能力 | ~85% |
準(zhǔn)確率 | 在高復(fù)發(fā)率情況下準(zhǔn)確識(shí)別誘導(dǎo)性斷裂的能力 | ~96% |
快中子反應(yīng)堆 | 發(fā)生于突變以背景水平出現(xiàn)的復(fù)發(fā)期 | ~6.5% |
FPR | 假陽性率 | ~15% |
NDUCE-seq 可重復(fù)地、無偏倚地檢測基因編輯誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂
結(jié)果顯示，在三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，總斷裂數(shù)和基于序列的脫靶位點(diǎn)數(shù)量均具有高度可重復(fù)性。不同細(xì)胞類型中DSBs的積累趨勢存在差異，而CRISPR-Cas9活性峰值出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后6小時(shí)。對(duì)五個(gè)靶點(diǎn)的分析進(jìn)一步證實(shí)，靶向與非靶向DSBs的檢測結(jié)果穩(wěn)定且一致。
結(jié)論
INDUCE-seq 提供了一個(gè)數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的、具有可操作性的見解平臺(tái)，旨在加速基因編輯項(xiàng)目在研發(fā)、臨床前和臨床階段的發(fā)展。通過其無偏倚、高精度且可重復(fù)的DNA斷裂檢測能力，它為解決基因編輯療法的安全性評(píng)估難題提供了關(guān)鍵工具，有助于確保這些創(chuàng)新療法的安全開發(fā)。
Broken String Biosciences是英國卡迪夫大學(xué)的衍生公司，致力于幫助基因編輯團(tuán)隊(duì)加快更安全、更有效的基因藥物的開發(fā)。其成功開發(fā)出的一種高靈敏度、全基因組范圍的DNA雙鏈斷裂檢測新方法——INDUCE-seq®，不僅可精準(zhǔn)識(shí)別基因編輯工具在預(yù)設(shè)靶位點(diǎn)誘導(dǎo)的雙鏈斷裂，還可系統(tǒng)性捕獲其在基因組非靶向區(qū)域引發(fā)的脫靶斷裂事件。目前，Broken String Biosciences已與全球多家基因編輯企業(yè)建立戰(zhàn)略合作，為其提供早期、全面的編輯效應(yīng)評(píng)估服務(wù)，從而助力提升產(chǎn)品安全性評(píng)價(jià)的科學(xué)性與可靠性，加速從臨床前研究向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化進(jìn)程。本技術(shù)的核心使命在于增強(qiáng)基因編輯過程的可預(yù)測性與可控性，推動(dòng)基因編輯技術(shù)向安全、有效、可監(jiān)管的臨床治療方案穩(wěn)健發(fā)展。
北京西美杰科技有限公司是Broken String Biosciences中國一級(jí)代理，始終秉承著專業(yè)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度為客戶提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù)。
